曲张大隐静脉病理组织学变化及组织中诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达(一)

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作者：闫雷 朴金花 孙权 孙洁 李梅秀 钟震亚

【摘要】 　　目的 探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在曲张大隐静脉血管组织中的表达和意义。方法 临床手术剥离获取曲张大隐静脉曲张段、未曲张段各10例，正常大隐静脉8例，采用Weigert氏间苯二酚品红法、天狼猩红染色法测定各组弹性纤维及胶原纤维分布及变化；免疫组化法测定各组iNOS 蛋白表达，分析iNOS 蛋白表达与大隐静脉曲张发生的关系。结果 与正常对照组比较，曲张大隐静脉曲张段与未曲张段均出现管壁内弹性纤维断裂，分布不连续，排列紊乱，含量明显减少（P0.05）；而胶原纤维的含量增加（P0.05）,且曲张大隐静脉曲张段中胶原纤维含量增加明显高于未曲张段（P0.05）；iNOS蛋白在曲张大隐静脉曲张段组织中表达明显增高，差异有统计学意义（P0.05）。结论 大隐静脉曲张发生与大隐静脉管壁iNOS蛋白表达增高有关。

【关键词】 大隐静脉； 静脉曲张； 一氧化氮合酶（NOS） 诱导型一氧化氮合酶（iNOS）

　　有研究认为大隐静脉管壁的曲张主要是由于平滑肌细胞的分离、变性，而不是因为结缔组织成分的异常〔1〕，另有研究则认为胶原纤维的增多是造成大隐静脉曲张的重要原因〔2〕。一氧化氮(NO)是一个普遍存在的第二信使，性质活泼，半衰期短，因此关于NO的研究都集中在一氧化氮合酶(NOS)上。最新研究显示，在动脉瘤组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达增高，NO大量合成；NO直接参与弹力纤维的降解和新血管的形成，其机制为NO氧化生成高浓度的亚硝酸盐直接与弹力蛋白发生反应，导致其降解，促进动脉瘤的发生〔3〕。另有研究表明，精索静脉曲张患者精索内静脉NO含量明显升高〔4〕。而人曲张大隐静脉组织中iNOS表达的研究尚未见报道。本实验对比观察正常和曲张的大隐静脉组织中的iNOS蛋白的表达，从分子水平探讨iNOS与大隐静脉曲张发生的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象及分组

　　正常对照组：股动脉栓塞行高位截肢术患者（未进行大隐静脉动脉化治疗）8例；男6例，女2例，年龄69～82岁，术后取其正常大隐静脉8根。试验组为临床确诊大隐静脉曲张患者10例，男2例，女8例，年龄39～68岁。试验观察组Ⅰ：行高位结扎剥脱术剥离大隐静脉后取曲张段；试验观察组Ⅱ：行高位结扎剥脱术剥离大隐静脉后取未曲张段。取材过程避免人为损伤。选择2009年5～11月北京市朝阳医院血管外科住院病人，且诊断明确并有详细的病历记录。

　　1.2 方法

　　1.2.1 取材及固定

　　手术剥离获取大隐静脉，立即用中性甲醛固定，脱水包埋，石蜡切片，厚度约4 μm。同一标本平行切片3个，分别进行Weigert、天狼猩红染色和免疫组化染色。

　　1.2.2 Weigert氏间苯二酚品红法观察弹力纤维

　　常规脱蜡，入无水乙醇中2 min，95％乙醇2 min。将切片入上述配制的染液中染色20～60 min，95％乙醇分化，显微镜下控制，水洗，逐级酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。染液由北京市朝阳医院病理科配置。结果：弹力纤维呈深蓝色。

　　1.2.3 天狼猩红染色法观察胶原纤维

　　常规脱蜡，流水冲洗5 min，蒸馏水浸泡1 min。入天狼猩红苦味酸染色30 min。无水乙醇直接分化兼脱水。二甲苯透明，中性树胶封片。染液由北京市朝阳医院病理科配置。结果：胶原纤维呈红色，其他为黄色。

　　1.2.4 免疫组化染色（PV9000两步法）

　　iNOS免疫组化试剂购自武汉博士德试剂公司，按照试剂盒说明使用时1∶60稀释；Anti?iNOS兔抗人多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗PV9000（工作液）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。结果：阳性部位呈棕色反应。