MicroRNAs在SLE患者外周血中的异常表达(一)
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作者：尹志华, 叶志中, 罗秀霞, 何伟珍, 徐珊
【摘要】 目的: 通过比较微小RNAs（microRNAs）在系统性红斑狼疮患者和正常健康对照人外周血单个核细胞中的表达情况, 发现在SLE中异常表达的microRNAs。方法: 分离外周血单个核细胞, 其中SLE患者20例, 健康对照组15例。将SLE患者和健康对照组的PMBC分别混合, 提取总RNA, 分离提纯microRNA, 探针标记, 芯片杂交, 扫描后进行数据分析。以两组间信号强度比值>2或者0.5表示两组间microRNAs表达差异有统计学意义。结果: 两组共筛选出27种有效表达的人源性microRNAs, 其中SLE组和对照组表达无明显差异的有14种, 11种microRNAs在SLE组中高表达, 2种microRNAs在SLE组中低表达。结论: 多种microRNAs在SLE患者外周血单个核细胞中异常表达, 提示它们可能在SLE的发生发展中起着重要的调控作用。
【关键词】 系统性红斑狼疮 微小RNA 芯片
许多生物基因组内存在一类非编码蛋白的RNA基因, 其转录物在某种机制下被加工成长度大约19～24个核苷酸的小RNA, 它们被命名为微小RNA（microRNA）。microRNA具有调节其他基因表达的活性, 在不同水平上发挥着发育控制、 基因调控、 RNA切割和基因重组等方面的功能, 最近研究显示microRNA在某些疾病如糖尿病、 肿瘤等的发生发展中发挥重要的作用[1, 2]。而有关在自身免疫性疾病中的作用目前还未有报道, 我们检测了系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）患者和正常健康对照人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC） 中的表达情况, 发现有一系列microRNAs在SLE中异常表达。
1 材料和方法
1.1 材料 TRIzol购自美国Life Technologies公司; mirVana microRNA分离试剂盒、 mirVanaTM microRNA标记试剂盒购自Ambion公司; Monoreactive Cy3 dye/Monoreactive Cy5 dye购自Amersham Pharmacia Biotech公司; microRNA芯片购自深圳微芯公司; microRNA探针文库来自Invitrogen公司; 芯片点样仪购自GE AMERSHAM公司; PowerMatrix标准Oligo芯片片基购自FULLMOON公司。20例SLE患者（其中女性16例, 男性4例）, 年龄（29.35±8.27）岁, 均符合1982年美国风湿病学会修订的SLE诊断标准; 15例正常对照人群（其中女性12例, 男性3例）来源于我院体检门诊, 排除高血压、 心脏病、 糖尿病及自身免疫性疾病, 年龄（31.44±6.56）岁。
1.2 方法
1.2.1 microRNA芯片的制作 microRNA探针文库及根据文献报道和预测分析由微芯公司自行设计合成的探针共1152个, 均为34～44碱基长, Tm值一致。其中包括重复点样的331个人类来源的microRNAs、 236个小鼠来源的microRNAs、 189个大鼠来源的microRNAs、 以及142个预测的microRNAs; 其他为各种阴性对照和外参照分子。采用芯片点样仪点制在标准Oligo芯片片基上, 按照标准流程进行固定, 干燥保存或用于芯片实验。
1.2.2 microRNA的提取 抽取受检人群的外周抗凝血2 mL, 淋巴细胞分离液分离PBMC, 分别将SLE患者组和健康对照组的PBMC混合, 加入TRIzol裂解, 按mirVana分离试剂盒的说明提取总RNA和microRNA, 采用A值测定和电泳检查确定样品总RNA量和质量。
1.2.3 microRNA的标记和纯化 利用Poly（A）聚合酶给microRNA样品加Poly（A）尾, 按mirVanaTM标记试剂盒的说明进行microRNA荧光标记和纯化。
1.2.4 芯片杂交和数据分析 将荧光标记的microRNA探针变性后加到芯片上, 盖上盖玻片, 放入杂交舱并封好, 放置于42℃空气浴摇床中以300 RPM速度晃动18～24 h。洗片, 干燥后扫描, 将图像转化为基于荧光强度的数字信号(Imagequant 5.0; Array Vision 6.0), 随后进行数据分析和处理。
1.2.5 统计学处理 统计学意义判断标准是校正后的两个样品间杂交信号强度的比值, 以比值>2或0.5代表有明显的表达差异。
2 结果
2.1 microRNA提取的质量 分别将SLE患者组和健康对照组的PMBC混合后提取总RNA和microRNA, 电泳结果显示两组混合样品总RNA均有清晰的18S和28S条带, A260/A280比值符合要求, 样品质量符合实验要求。