不同强度恒磁场协同顺铂促进U2骨肉瘤细胞凋亡的分子机制(一)
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作者：戴闽，詹平，熊高飞，熊建卫
【摘要】 〔目的〕探讨不同强度恒磁场促进顺铂诱导的U2骨肉瘤细胞（U2-OS）细胞凋亡及p53、bcl-2、c-myc基因表达变化的情况。〔方法〕分别使用1 mT、10 mT、100 mT恒磁场和加入3.0 μg/ml顺铂的细胞培养液共同培养U2-OS细胞24 h。采用四甲基氮唑蓝比色法（MTT法）、流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测恒磁场和顺铂联合对U2骨肉瘤细胞体外增殖、凋亡及相关基因表达。〔结果〕不同强度恒磁场能促进顺铂对人U2-OS细胞的抑制作用，10 Gs场强下其抑制率、凋亡率最高；凋亡率达37.66%，而p53 mRNA表达最强，bcl-2、c-myc mRNA表达最弱。〔结论〕不同强度恒磁场协同顺铂通过诱导细胞内p53、bcl-2、c-myc基因表达的变化是其抗肿瘤的机制之一，10 Gs场强下协同顺铂的抗肿瘤作用最强。
【关键词】 骨肉瘤； 化疗； 恒磁场； 凋亡机制
Abstract: 〔Objective〕To approach the expression of p53，bcl-2，c-myc genes and apoptosis induced by cisplatin associated with constant magic field at different intensities in U2-OS cells. 〔Methods〕Constant magic field at different intensities (10Gs, 100Gs, 1 000Gs), cell culture fluid including 3.0μg/ml cisplatin were used to culture U2-OS cells for 24 h. MTT, RT-PCR, flow cytometry(FCM)were used to eva luate tumor cell proliferation,gene expression and apoptosis in vitro.〔Results〕Constant magic field at different intensities promote the inhibitory effect of cisplatin. The effect of cisplatin with 10Gs constant magic field made the maximum inhibition rate and the apoptosis rat. The apoptosis rate was 37.66%. RT-PCR showed maximum p53 expression,and minimum bcl-2,c-myc expression.〔Conclusion〕Constant magic fields at different intensities promote plus cisplatin can induce p53, bcl-2 and c-myc expression. Ten Gs of constant magic field has the strongest antineoplastic effect.
Key words：osteosara; chemotherapy; constant magic field; apoptosis
顺铂做为一种公认的抗骨肉瘤化疗方案中一线药物，在临床上使用广泛。但越来越多的化疗耐药及对化疗不敏感的病例出现使骨肉瘤治疗疗效停滞不前。通过研究不同强度的恒磁场对顺铂作用的人U2-OS细胞凋亡的分子机制，为提高骨肉瘤对化疗的敏感性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 （1）细胞来源及其培养：人U2-OS细胞株购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，在含5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中，用含10%胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM培养基（HyClone公司）培养，用0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）消化传代。（2）药物和主要试剂：顺铂为Sigema公司实验用试剂，用生理盐水配制成1mg/ml的储存液，使用时用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释成3.0 μg/ml浓度。噻唑蓝 ( MTT )购于上海普飞生物技术有限公司。DMSO试剂购于Sigema公司。TRIzol试剂产自Invitrogen公司。DEPC产自Ameresco公司。M-MLV Reverse Transcriptase、Rnasin、dNTP、Oligo(dT)15均产自Promega公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 分组及处理 细胞呈对数生长后，实验分组为：①空白对照组；②阳性对照组：加入顺铂浓度3.0 μg/ml的细胞培养液；③实验组1∶加入顺铂浓度3.0 μg/ml的细胞培养液+1 mT恒磁场共培养；④实验组2：加入顺铂浓度3.0 μg/ml的细胞培养液+10 mT恒磁场共培养；⑤实验组3：加入顺铂浓度3.0 μg/ml的细胞培养液+100 mT恒磁场共培养，作用时间为24 h。
1.2.2 四唑蓝比色法（MTT法） 取对数生长期 U2-OS细胞经胰酶消化后计数,调整细胞密度为 5×104/mL,接种于96孔板,每孔100 μL。设调零组、①②③④⑤组,每孔设5复孔,按上述方法处理细胞后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL,继续孵育4 h,每孔加入200 μL的二甲基亚砜(DMSO)终止,然后再振荡15 min, 450型 ELISA- Reader酶标仪490 nm主波长, 572 nm副波长检测吸光度。重复实验3次。以空白对照组细胞活力为100%,按公式计算对U2-OS细胞增殖的抑制率。公式：细胞抑制率(%)=(1-药物组吸光度/对照组吸光度)×100%。
1.2.3 流式细胞术检测凋亡 用胰酶消化收集上述各组细胞，应用FACSCalibar流式细胞仪（Beckton Dickinson ,USA）分析，氩离子激光器激发波长为488 nm，在流式细胞仪上进行细胞周期分析，得出细胞凋亡百分率。
1.2.4 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR法） 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR法）检测各组细胞mRNA表达（图1）。采用Trizol试剂提取细胞总RNA，合成cDNA。 PCR扩增p53、c-myc和bcl-2应用Primer Primier 5软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成, p53上下游引物分别为5’-TGGAGGATTCACAGTCGG-3’及5’-GGTGGAAGATAGTTGC-3’，扩增产物187bp；c-my上下游引物分别为5’- AGAGTTTCATCTGCGACG -3’及5’-GCTGCGTAGTTGTGCTGATGTG-3’，扩增产物595bp；bcl-2上下游引物分别为5’-TGTGTGTAAACATAGATTCGC-3’及5’-CTTAGACATCGGAGAA-3’，扩增产物742bp；同一标本扩增以β-actin做为内参照。β-actin上下游引物分别为5’- ACACTGTGCATCTACGAGG-3’及5’-AGGGGGGACGCGTCATACT-3’，扩增产物621 bp。 PCR通过94℃预变性5 min,94℃ 45 s，55℃ 60 s，72℃ 45 s，35个循环后72℃终末延伸10 min。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳(含5mg/L溴化乙锭)后,在紫外灯下观察结果。通过FR200图像分析软件（上海复日公司）读取目的电泳条带的斑点密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值为标准，测算其相应组的p53、c-myc、bcl-2 mRNAs的表达量。
1.2.5 统计学方法 采用SAPSS 13.0统计软件进行统计分析，实验数据用x-±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结果
2.1 各组细胞体外增殖抑制实验
MTT检测显示磁场强度为1 mT的实验组细胞增殖显著低于对照组及磁场强度为10 mT、100 mT的实验组（P＜0.05）。各组A值及抑制率见表1。表1 不同强度恒磁场协同顺铂作用后U2-OS增殖抑制结果组别*与实验组2、3比较有统计学差异，P＜0.05；△与对照组比较有统计学差异，P＜0.05