HSV1?tk自杀基因系统对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应(一)

详细内容

作者：刘晶晶,杜标炎,谭宇蕙,吴映雅,周瑶,刘喜娟

【摘要】 【目的】检测自杀基因系统单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1?tk/GCV)对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应。【方法】将B16/tk(tk+)细胞和未经修饰的B16(tk-)细胞按tk+细胞占总细胞数的0%、10%、20%、40%、80%比例分别进行混合,各组细胞于96孔板中培养,加入丙氧鸟苷(GCV)至15?7 μmol/L,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同tk+细胞比例的HSV1?tk/GCV系统在体外对肿瘤细胞的杀伤率。各组混合细胞分别接种于小鼠腋下，以GCV注射液按100 mg・kg-1・d-1进行治疗,检测瘤体体积、湿质量,测定抑瘤效应。【结果】tk+比例10%以上治疗组,HSV1?tk/GCV系统对黑色素瘤B16细胞均有明显杀伤效应,但旁杀伤作用不明显;从移植瘤体积看,20%以上tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P 0?05),以80%tk/GCV治疗组作用最显著(P 0?01);从移植瘤质量看,80%tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P0?01),其他组虽随着tk+细胞比例的增高瘤体平均质量下降,但差异无显著性意义。【结论】HSV1?tk/GCV系统对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应均随着B16/tk细胞比例的增高而增强，已建立显示出体外杀伤效应和体内抑瘤活性的小鼠黑色素瘤自杀基因系统。

【关键词】 黑色素瘤;自杀基因系统/治疗应用;基因疗法;细胞培养

恶性黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的肿瘤,其发病率在世界范围内位居所有恶性肿瘤中第7位。致死率高的主要原因在于黑色素瘤细胞本身抗凋亡能力强及生长微环境血供丰富。肿瘤的基因治疗,特别是肿瘤自杀基因治疗已经成为最具应用前景的、崭新的肿瘤综合治疗措施之一。目前已在临床病人及实验动物上广泛应用于肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、脑瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤的治疗,并已观察到较好的效果[1-2]。该方法的一个显著特点是存在旁观者效应(bystander effect), 即加入前体药物后,不仅导入了自杀基因的细胞被杀死,邻近未导入的细胞也可被杀死[3-5],但也存在许多不足,限制其广泛应用的关键之一是不能将目的基因导入每一个待治疗的受体细胞,体内转染率通常只有10%左右。因而增强旁杀伤效应目前已成为提高自杀基因疗效的重要策略。本实验观察了不同比例B16/tk与B16对体外和体内抑瘤效应的影响,为探讨中医药增强自杀基因疗法疗效的可能性进行前期准备工作。现报道如下。

　　1材料与方法

　　1?1药物及配制丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)为丽珠集团湖北科益药业有限公司产品,注射用粉针剂(批号：080801082),0?15 g/支,临用前采用注射用生理盐水15 mL溶解,浓度为10 g/L。

　　1?2主要仪器及试剂细胞培养用RPMI?1640粉和胰蛋白酶为Gibco公司产品,青、链霉素合剂为杭州吉诺生物医药技术有限公司出品,新生牛血清为奥地利PAA公司产品,四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均为美国Sigma公司产品,IX71?F22FL/PH型荧光倒置显微镜及图像采集系统(日本Olympus公司),Bio?Rad?680型全自动酶标仪(美国Bio?Rad公司)。

　　1?3细胞株小鼠黑色素瘤细胞株B16购自中山大学动物中心细胞库。病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司,本课题组已构建重组PT67/tk,并将其产生的重组pLXSN/tk的逆转录病毒转染到B16细胞内并筛选到稳定整合株,记为B16/tk [6]。

　　1?4细胞培养用完全培养基(含RPMI?1640培养基、体积分数10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、0?1 mg/mL链霉素)接种在培养瓶中,置体积分数5%CO2、37℃培养至融合率80%～90%时传代进行实验,接种细胞浓度为1×105/mL。

　　1?5动物C57BL/6J小鼠,18～22 g,雄性,健康,SPF级,购自中山大学实验动物中心，合格证号：SQAK(粤)2004?0011。

　　1?6tk/GCV对小鼠黑色素瘤细胞株B16的体外杀伤效应B16(tk-)和B16/tk(tk+)按tk+细胞占总细胞数的0%、10%、20%、40%、80%、100%混合,以2×104个/mL的密度将细胞接种于96孔板,体积为每孔100 μL,培养24 h后每孔加入终浓度为15?7 μmol/L GCV,并加入RPMI?1640培养基至每孔总体积为200 μL。每组设6个复孔,培养箱中培养72 h,MTT法检测：加药培养后,吸弃每孔上清,每孔加入无血清RPMI?1640细胞培养液90μL和MTT10 μL(500mg/L),置于培养箱内培养4h后,吸弃全部上清培养液,加入DMSO 150μL,震荡10 min,然后用酶标仪在490 nm波长下测定每孔吸光值(D)。

　　1?7小鼠移植性黑色素瘤的模型复制及治疗选用C57BL/6J雄性小鼠54只,随机分为正常对照组、模型组、0%tk/GCV组、20%tk/GCV组、40%tk/GCV组、80%tk/GCV组共6组,每组9只。将B16/tk和野生型B16按tk+细胞占总细胞数的0%、20%、40%、80%比例混合,接种前镜下观察黑色素瘤细胞形态。将混合后的小鼠黑色素瘤细胞制备成2×109个/L的细胞悬液,台盼蓝活细胞计数>90%。常规酒精消毒C57BL/6J小鼠右侧腋下皮肤,按0?1 mL/只悬液(含2×105 个肿瘤细胞)分别接种小鼠右前肢腋下组织内造模,记为模型组、0%tk/GCV组、20%tk/GCV组、40%tk/GCV组、80%tk/GCV组。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水0?1 mL/只。正常对照组和模型组第8～15天以蒸馏水腹腔注射0?2 mL・d-1・只-1，其他各组第8～15天腹腔注射GCV,给药剂量为100 mg・kg-1・d-1。

　　1?8观察项目

　　1?8?1一般状况观察小鼠活动情况、毛发、营养、肿瘤生长及死亡等情况。

　　1?8?2肿瘤体积在肿瘤出现后每天用游标卡尺测定肿块的长径a(cm)及与之垂直的短径b(cm),计算肿瘤体积[7]：V(cm3)=0?5×a×b2,根据测量的肿瘤体积绘制肿瘤生长体积曲线图。

　　1?8?3肿瘤质量实验结束后处死动物,仰面固定,用眼科剪分离剥取肿瘤,万分之一电子天平称湿质量,记录结果。计算抑瘤率[8] ：p抑瘤(%)=(m模型组-m治疗组)/ m模型组×100%。

　　1?9统计学方法采用SPSS 10?0统计软件包,组间比较用LSD法。肿瘤质量数据的处理是先进行数据对数转换,随后进行方差分析。

　　2结果

　　2?1GCV体外杀伤效应铺板后倒置显微镜下观察细胞,可见细胞均匀透亮,胞膜完整,胞体呈圆形,悬浮于培养液中;24 h后,细胞呈现贴壁状态,细胞形态为扁平的多角形,胞质均匀,胞膜完整,各组间无明显差异;48 h和72 h后,B16/tk的给药孔中均见细胞死亡,表现为细胞变圆,大片漂浮,胞膜不完整,并且碎裂成小粒状,tk+细胞比例越高,死亡细胞数越多。野生型B16细胞对照组及给药孔均呈现明显的细胞增殖,GCV对其无明显作用(图1，彩图见第438页)。MTT检测显示,B16对照组和0%tk/GCV组抑制率差异无显著性意义(P>0?05)。而B16tk/GCV各组随着tk比例的增加细胞密度逐渐降低、抑制率明显增加,但旁杀伤效应不明显(见表 1)。

　　2?2各组小鼠一般状况、成瘤时间及成瘤率正表 1不同tk+细胞比例对tk/GCV系统杀伤B16细胞的影响常对照组小鼠体形正常,运动快速有力,反应灵敏,被毛浓密有光泽,黑色,紧贴身体而不粗乱蓬松。其他组小鼠随着肿瘤的增大,逐渐表现为活动迟缓,被毛无光泽,肿瘤越大表现越突出。模型组、0%tk/GCV组、20%tk/GCV组、40%tk/GCV组在接种第11天后陆续可触及皮下肿瘤,成瘤率为100%;80%tk/GCV组接种第12天后陆续可触及皮下肿瘤,成瘤率为11?1%(注：计算成瘤率时在模型组出现首例肿瘤前死亡动物不作为总数计算)。