MMP?2、MMP?9和VEGF在肾癌中的表达与临床意义(一)
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作者：卜宏民 王连渠 闫拥军 焦志灵 徐国良
【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶?2、?9(MMP?2、MMP?9)与血管内皮生长因子（VEGF）在肾癌组织中的表达与临床分期的意义。方法 蛋白免疫印迹法、ELISA和逆转录聚合酶链反应法（RT?PCR）检测癌组织MMP?2、MMP?9，蛋白质免疫印迹法和RT?PCR检测癌组织VEGF。结果 肾癌组织中MMP?2、MMP?9和VEGF明显表达，随着病程的进展MMP?2、MMP?9和VEGF活性逐渐增高，以Ⅳ期晚期最明显，VEGF与MMP?2、MMP?9表达具有正相关性。结论 MMP?2、MMP?9和VEGF参与了肾癌临床病情进展和发病机制。
【关键词】 肾癌；基质金属蛋白酶；血管内皮生长因子
基质金属蛋白酶(MMP?2和MMP?9）及其组织抑制物因子(TIMPs)在恶性肿瘤浸润转移中的作用已成为研究热点〔1，2〕，其中能够水解基底膜主要成分Ⅳ型胶原的MMP?2(明胶酶A)、MMP?9(明胶酶B)由于参与了细胞外基质(ECM)的降解和血管的发生，被认为在恶性肿瘤的浸润转移中发挥重要的作用〔2〕。血管内皮生长因子（VEGF）是一种增加血管通透性并促进新血管生长的细胞因子，在许多恶性肿瘤呈高表达并与侵袭转移和预后等生物学行为关系密切，可能与肿瘤及肿瘤转移灶的生长中的血管生成有关〔3，4〕。但三者在肾肿瘤组织中表达及其关系的文献报道的还不多，本文检测了肾癌组织中MMP?2、MMP?9和VEGF的表达，探讨其与肾癌临床分期的关系与意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 67例肾癌标本取自2004年1月～2007年10月在本院外科手术切除的肾癌患者。其中男33例，女34例，年龄36～82（平均54±18.5）岁。按国际抗癌联盟(1987年)，TNM分期：其中I期4例，Ⅱ期27例，Ⅲ期30例，Ⅳ期6例。全部患者均经手术及病理证实。所有患者术前均未行放、化疗，手术标本取材后立即放人液氮罐保存。肾癌临床分期标准根据肾壁增厚程度及是否外侵、有无远处转移，可将肾癌分为4期，Ⅰ期(即早期)：腔内肿块或局限性肾壁厚(3～5 mm)；Ⅱ期：肾壁厚＞5 mm，但未侵及纵隔，也无远处转移；Ⅲ期：肾壁厚＞5 mm，侵犯周围组织，也可以有纵隔淋巴结肿大，但无远处转移；Ⅳ期：肾壁厚＞5 mm，不但侵犯周围组织，且有远处转移。
1.2 方法
1.2.1 ELISA MMP?2、MMP?9和VEGF抗体和酶联免疫吸附法试剂盒购自福建迈新生物科技发展有限公司。液氮罐保存肾癌组织按2.5 ml/g质量加入相当体积的冰生理盐水，用匀浆器将组织研磨，然后在冰浴下超声波粉碎制成匀浆，4℃，10 000 r/min离心10 min，取上清液。实验严格按照MMP?2、MMP?9和VEGF酶联免疫吸附法说明书步骤进行。
1.2.2 Western印迹检测法 用Western印迹方法检测肾癌组织MMP?2、MMP?9、VEGF含量。按10 ml/g的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量。10％的十二烷基硫酸钠?聚丙稀酰胺凝脑电泳（SDS?PAGE）法上样量为28 μg。电泳条件:4℃。电流20～30 mA。电泳结束后，进行蛋白质转膜。转膜条件：采用孔径为0.22 m的硝酸纤维素膜(NC)，4℃,电流400 mA，转膜3 h。Western印迹杂交步骤如下：10％脱脂牛奶封闭NC膜1 h，TYBS(20mmol/L Tris?HCl，pH 7.5；0.15 mmol/L NaCl；0.05％Tween 20)漂洗3次，每次10 min，然后室温下与APP、MBP(1∶1 000)杂交反应3 h，吐温20/Tris盐酸缓冲液（TTBS）漂洗同前。再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)杂交反应1 h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10 min，加入ECL试剂反应5 min，保鲜膜包裹，暗室X?光胶片曝光、显影和定影。然后同一张NC膜再与β?actin(1∶1 000)进行Western印迹杂交反应,并获得蛋白印迹结果。Western印迹条带经Gel?oc凝胶成像分析系统扫描处理，计算单位吸光度值和条带面积，将各实验点的总吸光度值与对照组比较，得到相对百分数。
1.2.3 逆转录聚合酶链反应法（RT?PCR） 提取各组肾癌组织总RNA并定量,用DNA 酶Ⅰ处理总RNA 以去除DNA污染,各实验组取同等量的RNA反转录后进行PCR。MMP?2、MMP?9和VEGF PCR引物设计见表1(北京奥科生物科技有限公司)。将PCR扩增的产物5 μl在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压一般为70～80 V。电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果用Quantity One?4.4.0软件行定量分析，以目的基因与β?actin条带平均光密度比值表示目的基因mRNA的相对表达量。表1 MMPs和VEGF PCR引物设计
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件包进行统计学处理，组内不同时相点的比较采用方差分析，组间同一时相点的比较采用t检验，One?way Pearson线性相关分析。
2 结 果
2.1 肾癌组织ELISA法MMP?2、MMP?9和VEGF的水平比较 酶联免疫吸附法检测显示Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肾癌组织MMP?2/MMP?9和VEGF明显表达。与Ⅰ期比较，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肾癌组织MMP?2/MMP?9和VEGF的水平均有增高(P＜0.01)，MMP?2/MMP?9和VEGF在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肾癌组织中明显表达，尤其Ⅳ期肾癌组织中表达最明显。见表2。
2.2 MMP?2、MMP?9和VEGF Western印迹水平比较 蛋白质印迹法检测MMP?2/MMP?9和VEGF结果与酶联免疫吸附法检测结果具有一致性，MMP?2/MMP?9和VEGF在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肾癌组织中明显表达，尤其Ⅳ期肾癌组织中表达最明显(P＜0.01)。图1和表3。表2 ELISA法MMP?2/MMP?9和VEGF表达表3 Western印迹水平比较MMP?2/MMP?9 和VEGF的表达
2.3 MMP?2，9和VEGF RT?PCR水平比较 TR?PCR检测大鼠脑组织mRNA MMP?2/MMP?9和VEGF的表达水平与蛋白质表达水平结果也具有一致性，MMP?2/MMP?9和VEGF在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肾癌组织中明显表达，尤其Ⅳ期肾癌组织中表达最明显(P＜0.01)。图2和表4。表4 mRNA水平比较MMP?2/MMP?9和VEGF的表达