抗HIV1 Tat蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定(一)

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【摘要】 目的: 制备抗HIV?1 Tat蛋白的单克隆抗体（mAb）, 并对其进行初步鉴定。方法: 通过动物免疫、 细胞融合、 克隆化制备抗Tat蛋白的mAb, 并用ELISA法对所得mAb的特异性、 抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。结果: 获得了3株抗Tat蛋白的mAb, 这3株mAb均能特异识别Tat蛋白。结论: 获得了3株杂交瘤细胞系, 均可以稳定分泌抗HIV?1 Tat蛋白的mAb, 有望为HIV早期检测及HIV抗病毒治疗提供有用工具。

【关键词】 HIV?1 Tat 单克隆抗体

　　自1981年发现艾滋病以来, 艾滋病（acquired immunodeficiency disease, AIDS）在全球迅速扩散, 人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）是引起AIDS的病原体。HIV有许多结构蛋白以及调节蛋白, 其中Tat蛋白是很重要的调控蛋白之一, 是HIV基因复制和表达调控所必需的〔1〕。Tat蛋白由2个外显子编码, 其中第1个外显子编码l～72位氨基酸残基, 第2个外显子编码73～101位氨基酸残基。由第1个外显子编码的72个残基的肽段具有完全的体外反式激活活性。Tat是HIV最早产生的病毒蛋白之一, 其入核后通过结合HIV长末端重复序列和反式激活效应元件, 进一步促进病毒RNA的产生, 是病毒复制的重要激活分子〔2〕。本研究中通过免疫BALB/c小鼠获得Tat蛋白的单克隆抗体（mAb）, 并用ELISA等方法检测mAb的性质, 为HIV早期检测以及抗病毒治疗提供了新的思路。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　纯化的Tat蛋白由美国丹佛大学惠赠。BALB/c小鼠（6～8周龄）购买第四军医大学实验动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为本试验室保存。RPMI1640干粉培养基购自Gibco公司。小牛血清购自四季青公司。酶标山羊抗小鼠IgG抗体购自TaKaRa公司。小鼠Ig亚类检测试剂盒、福氏佐剂及PEG购自Sigma公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物免疫

　　取Tat蛋白28 μL, 加0.02 mol/L的PBS(pH7.4) 1.472 mL使成1.5 mL浓度溶液, 加等量福氏完全佐剂用三通器混匀制成油
包水的乳化液。在5只BALB/c小鼠的颈背部及双侧腹股沟皮下多点注射, 剂量为0.6 mL/只, 间隔3周后以同样方法(加不完全福氏佐剂乳化)免疫, 再间隔2周后取等量蛋白溶于生理盐水中经腹腔进行第3次免疫, 最后1次免疫2周后测小鼠血清效价, 选择血清效价高的小鼠再经腹腔加强免疫, 3 d后取脾细胞进行融合。

　　1.2.2 mAb细胞株的建立

　　取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合, 融合剂为相对分子质量（Mr）1 500的PEG。细胞融合及选择性培养均按常规方法〔3〕进行。以10 mg/L的Tat蛋白包被聚苯乙烯微板, 用间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清, 以正常BALB/c小鼠血清作为阴性对照, 以免疫BALB/c小鼠血清作为阳性对照。采用有限稀释法对检测阳性孔细胞进行3次克隆化, 直到克隆生长孔mAb阳性率达100％, 建立单克隆细胞株。将阳性杂交瘤细胞株扩增培养后液氮冻存。

　　1.2.3 mAb腹水的制备及其效价测定

　　取建株的杂交瘤细胞扩大培养后, 以1×106个细胞接种于已注射石蜡油的BALB/c小鼠腹腔中, 按常规法收集、 制备mAb腹水〔3〕。以上述间接ELISA法检测mAb腹水效价。

　　1.2.4 mAb的纯化

　　采用正辛酸?硫酸铵法对小鼠腹水中的mAb进行纯化〔3〕。

　　1.2.5 mAb的特异性鉴定不同多肽检测mAb腹水

　　分别取Tat、 Gp41?5多肽及Bcsp31蛋白, 以20 mg/L浓度包被微板, 用间接ELISA法检测抗Tat蛋白的mAb腹水(分别以正常鼠血清为阴性对照)。

　　1.2.6 Ig类和亚类的鉴定

　　采用小鼠Ig类检测试剂盒对所获得的mAb进行鉴定, 具体方法参照试剂盒中的说明书进行。

　　1.2.7 mAb相对亲和力的测定

　　采用间接ELISA法测定〔4〕。以10 mg/L的浓度包被Tat蛋白, 加入系列稀释( 200 mg/L至10-8mg/L)的纯化mAb, 再加入HRP标记的羊抗鼠IgG, OPD显色后测定492 nm处的A值。以抗体浓度为横坐标, 以A492为纵坐标, 绘制曲线, 观察相对亲和力。

　　1.2.8 抗体相加实验分析mAb针对的抗原表位

　　确定各mAb反应饱和浓度后, 将各株mAb稀释至100 mg/L (该浓度均大于各mAb反应的饱和浓度)。以2 mg/L浓度包被Tat蛋白, 分别将各株mAb两两相加后加入微孔板, 另外各有一孔只加单独一种mAb。再加入酶标羊抗鼠IgG, 并经显色后测定492 nm处A值。相加指数按公式AI=〔 2A1+2/(A1+A2)-1〕×100％计算。公式中A1和A2分别为单独加1株mAb的A值, A1+2代表2株mAb相加所测得的A值。AI大于50％表示具有相加效应, 提示2株mAb针对不同抗原表位; AI在10％～50％之间表示2株mAb针对的抗原表位可能有差异; AI小于
10％则表示2株mAb针对的抗原表位相近。