针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡相关因子p53、bcl-2蛋白表达的影响(一)

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【摘要】 目的 本实验采用针刺联合抗癌新药紫杉醇对Lewis肺癌小鼠进行治疗,探讨针药结合对肿瘤的治疗作用及机制。方法 Lewis肺癌移植瘤小鼠48只,体重18～22 g,随机分为4组,即模型组、针刺组、药物组、针药结合组,每组12只。观察小鼠的生存状态、肿瘤体积的动态变化,应用Western Blotting法观察肿瘤组织中凋亡相关因子p53、Bcl-2蛋白表达情况。结果 针刺、紫杉醇、针刺联合紫杉醇均有抑瘤作用,但针药结合抑瘤作用最强,且能改善实验动物的生存状态。各组中均有p53、bcl-2蛋白表达,模型组表达最高；与模型组比较,针刺组、药物组、针药结合组表达明显低于模型组,有显著差异；针药结合组与针刺组和药物组比较,有显著差异。结论 针刺加紫杉醇具有联合抑制野生型p53基因突变,降低bcl-2蛋白表达的作用,两者具有协同效应。

【关键词】 针刺；紫杉醇；p53；bcl-2；Lewis肺癌；协同增效

Effect of Acupuncture bined with TAX on the Expression of Apoptosis Related Factor p53 and bcl-2 of Mice Lewis Lung Cancer Cells CHENG Ze-dong, CHEN Yi-guoGraduate School of Liaoning University of TCM, Shenyang 110032, China Abstract：Objective We adopt acupuncture associating with TAX, to investigate the anti-cancer effect and mechanism. Methods 48 mice with inoculated Lewis Lung Carcinoma were divided randomly into 4 groups：model group, acupuncture group, medicine group, bination of acupuncture and medicine group. Growth state of the mice and change curve of tumour. Protein expression of apoptosis related factor p53 and Bcl-2 in tumour were observed by Western Blotting method. Results Acupuncture, TAX and the bination of acupuncture and TAX separately had anti-tumor effect, with the bination was the best and improve growth state of the mice. p53 and bcl-2 can be detected in four groups. pared with model group, the expression of other groups was lower. pared with acupuncture group and medicine group, the exprission of bination group of acupuncture and TAX was lower. Conclution bination of acupuncture and TAX can prohibit p53 Mutant and decrease Bcl-2, which have co-operating effect. Key words：bination of acupuncture and medication；TAX；p53；bcl-2；Lewis cancer；co-operating effect 肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病,也是细胞凋亡异常的疾病,因此, 诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤药物发挥抗肿瘤作用的主要途径之一。本实验以针刺、紫杉醇、针刺联合紫杉醇三种方法治疗,观察针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis肺癌的抑制作用及对细胞凋亡相关因子p53、Bcl-2的影响。

1实验材料

1.1 动物 C57BL/6小鼠54只,雌雄各半,体重(20±2)g,京维通利华实验动物有限责任公司提供,合格证号：007250639,动物等级：SPF级。　1.2 试剂及药物 Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞株(中国医科大学免疫学教研室)；紫杉醇注射液(四川升和制药有限公司,浓度为30 mg/5 mL,批号050401)；兔抗p53、Bcl-2一抗(北京中杉生物公司)；碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG(北京中杉生物公司)；甘氨酸(GIBCO公司)；过硫酸铵(Promega 公司)；牛血清白蛋白(BSA,北京元亨圣马生物技术研究所)；酚试剂(Sigma公司)；硝酸纤维素膜(Immobilon-NC Transter Membranes MILLPORE), O-dianidine, 25 mg β-naphthyl acid phosphate (Sigma公司)。

2 实验方法

2.1 造模 Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞株从冻存的液氮内取出,37 ℃水浴复苏后分别接种于6只C57BL/6小鼠左后肢皮下,待瘤体长至1.0～1.5 cm时,处死小鼠；选择生长良好的瘤组织,无菌取出,剪碎,研磨,过滤,制成单细胞悬液；台盼蓝染色观察记录活细胞数(>90%),调整细胞浓度至活瘤细胞计数约1×107个/mL瘤细胞,给每只实验组小鼠左后肢内侧皮下接种0.2 mL(约含活细胞2×106个),即为荷瘤模型。

　　2.2 分组

接种后将动物均匀随机分为4组,每组12只,雌雄各半,即肺癌模型组(模型组)、肺癌＋针刺“肺俞”组(针刺组)、肺癌＋紫杉醇注射液组(药物组)、肺癌＋紫杉醇＋针刺“肺俞”组(针药结合组)。

　　2.3 紫杉醇注射液的制备

取紫杉醇溶液30 mg/5 mL,加生理盐水25 mL,制成1 mg/mL的紫杉醇注射液。

　　2.4 处理因素

接种后第5天开始治疗,连续治疗10 d。模型组：固定,每日每只腹腔注射等量生理盐水；针刺组：固定,针刺“肺俞”穴,每日1次；药物组：固定,每日每只腹腔注射紫杉醇注射液10 mg/kg；针药结合组：固定,针刺“肺俞”穴,20 min后腹腔注射紫杉醇注射液10 mg/kg,每日1次。针刺方法：顺经脉走行斜刺皮下约0.2 mm,用均匀手法小幅度捻转1 min,留针15 min,间歇行针两次(按照中国针灸学会学术部提供的大鼠穴位解剖图谱及比较解剖学取穴)。

　　2.5 取材

接种后第15天断颈处死动物,完整仔细地剥离肿瘤结节待测。

　　3 观察指标

　　3.1 小鼠生存状态

接种后第5天起,每组动物每日称重,观察动物进食、活动状态及死亡情况,并记录。

　　3.2 肿瘤体积的动态变化

接种后第5天起,每日用游标卡尺(精度为0.1 mm)测定肿瘤的最长径a和最短径b,按公式V=ab2/2(V为肿瘤体积,a为肿瘤长径,b为肿瘤短径)计算肿瘤体积,统计得出各组肿瘤平均体积,并绘制出生长曲线。

　　3.3 细胞凋亡相关因子p53和Bcl-2蛋白表达的检测

　　3.3.1 总蛋白的提取

　　将肿瘤组织块碾成粉末,加入已预冷的裂解液中, 在冰浴中用匀浆机匀浆2 min,14 000×g,4 ℃离心1 h,取上清于4 ℃存放备用。