不同宫内缺氧时程对胎鼠神经干细胞增殖的影响及当归保护作用(一)

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作者：陈滟　曹兵　梅欣明　曹坤　余鸿

【摘要】 目的探讨不同宫内缺氧时程对胚胎大鼠神经干细胞增殖的影响及当归注射液的保护作用。 方法将孕15 d的SD大鼠随机分为9组：对照组、缺氧3 h组、缺氧6 h组、缺氧9 h组、缺氧12 h组、当归3 h组、当归6 h组、当归9 h组和当归12 h组，每组5只。所有当归组孕鼠经尾静脉注入当归注射液，然后用低张性缺氧模型致胎鼠宫内缺氧；所有缺氧组用生理盐水代替当归注射液，其余同当归组；对照组只注盐水，不缺氧。取胎鼠大脑组织，作Nestin免疫组织化学染色、图像分析。结果缺氧3 h组、缺氧6 h组和缺氧9 h组阳性细胞较对照组染色增强，数量增多，缺氧12 h组阳性细胞较对照组减少，各缺氧组间比较有统计学差异；除当归12 h组外，其余各当归组阳性细胞较相应缺氧组染色减弱，数量减少；当归12 h组与缺氧12 h组间比较无统计学差异（P＞0.05）。结论一定时程、一定浓度的缺氧可以刺激神经干细胞进入增殖状态，其增殖的强弱与缺氧时程有关，缺氧6 h时达到增殖高峰, 缺氧9 h开始降低；长时程缺氧(12 h)会导致神经干细胞减少；当归对一定时程缺氧的胚胎大鼠神经干细胞有一定保护作用，而在缺氧12 h时失去保护作用。

【关键词】 神经干细胞； 缺氧；胚胎；增殖；当归

　　Abstract:ObjectiveTo study the influence of intrauterine hypoxia in different time on proliferation of embryo neural stem cells（NSE） and the protective effect of Angelica injection.MethodsThe pregnant SD rats in 15 days were randomly divided into 9 groups: control group (CG), hypoxia 3 h group(HG-3 h), hypoxia 6 h group(HG-6 h), hypoxia 9 h group(HG-9 h),hypoxia 12 h group(HG-12 h),Angelica group 3 h(AG-3 h), Angelica group 6 h(AG-6 h),Angelica group 9 h(AG-9 h),Angelica group 12 h(AG-12 h).Every group had 5 pregnant rats. The pregnant rats in Angelica groups were injected Chinese angelica injection via tail vein, and then the hypoxia model was used to cause embryo hypoxia in intrauterine. In hypoxia groups, 0.9% normal saline injection replaced Chinese angelica injecta, was injected in pregnant rats, and others were the same as Angelica group. The pregnant rats in control group were also injected 0.9% normal saline, but were not suffered hypoxia. After drawing materials, the cerebrum of rat embryo was carried out the immunohistochemical staining of Nestin.ResultsIn HG-3h, HG-6h,HG-9h,the immunoreactive positive cells of Nestin were deeper and more than the positive cells in CG. But the positive cells in HG-12 h were lighter and less than those in CG. And there had statistical difference between every hypoxia group. The positive cells of Nestin in AG-3 h were lighter and less than those in HG-3 h, the same as in AG-6 h and in AG-9 h. But there had no statistical difference between AG-12 h and HG-12 h （P＞0.05）.ConclusionHypoxia in some time and concentration (11%±1%) can stimulate embryo NSC into proliferation, and the degree of proliferation is related with time of hypoxia. NSC achieved the proliferation peak at hypoxia 6h and its proliferation ability was decreasing at hypoxia 9h. Long time hypoxia can cause reduction of NSC, as hypoxia 12 h.Chinese angelica has a certain protective function on the embryo rat NSC of hypoxia in some time, but lost this effect at hypoxia 12 h.

　　Key words:Neural stem cell; Hypoxia; Embryo; Proliferation; Angelica

　　宫内缺氧可导致围产期胎儿严重的大脑损伤，是新生儿神经系统后遗症的常见原因，而神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的增殖、分化是神经系统损伤修复的关键步骤。目前有研究表明，一定程度缺氧可增强NSCs的增殖能力。Yang等〔1〕研究表明缺血缺氧能增强围产期大脑室下区神经干细胞的再生能力。该实验小组〔2〕在前期的研究中发现宫内缺氧1 h可刺激神经干细胞增殖，但随着缺氧时间的延长将对NSCs产生怎样的影响目前尚未见报道。因此，研究不同缺氧时程对NSCs的影响，可为临床有宫内缺氧的胎儿的诊断、预后评价提供一定的理论依据。

　　目前宫内缺氧在临床治疗上方法比较局限，疗效不确定。当归作为妇科要药已有数千年历史，现代医学研究发现当归具有解除血管平滑肌痉挛、促进新生血管的形成、抗氧化及抗衰老等作用。为此，本实验设计了当归对不同宫内缺氧时程胚胎大鼠神经干细胞的影响，以期探明当归对宫内缺氧胚胎大鼠神经干细胞的有效作用范围，用以指导临床治疗。

　　1 材料

云南系健康成年雌性Wistar大鼠45只（体重250～300 g）由泸州医学院动物中心提供。250 g/L当归注射液购于湖北医科大学附属第二医院药剂科（批号：060926），小鼠抗Nestin购于Chemicon pany，免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。

　　2 方法

将45只大鼠分别与雄鼠配种，于第2天早晨发现阴栓记为怀孕0 d，单独饲养雌鼠至孕期15 d。将孕鼠随机分为9组：对照组(CG)，缺氧3 h组(HG-3 h)，缺氧6 h组(HG-6 h)，缺氧9 h组(HG-9 h)，缺氧12 h组(HG-12 h)，当归3h组(AG-3 h)，当归6h组(AG-3 h)，当归9 h组(AG-3 h)和当归12 h组(AG-3 h)，每组5只。所有缺氧组孕鼠先经尾静脉缓慢注射0.9%生理盐水8 ml/kg体重，然后放入装有200 g钠石灰(可吸收CO2)的4 000 ml容量的玻璃缸内，密闭缸盖，并维持缸内O2浓度在12%～10%之间（玻璃缸与测氧仪连接），直至达所需时间，再打开玻璃缸盖复氧2 h。然后脱颈处死孕鼠，快速剖腹取出胚胎，剪破胚胎颅骨，暴露部分脑组织后放入10%的中性福尔马林中固定12 h。所有当归组孕鼠用250 g/L的当归注射液（8 ml/kg体重）代替缺氧组的生理盐水，其余处理方法同缺氧组。对照组孕鼠经尾静脉缓慢注射0.9%生理盐水8 ml/kg体重，不缺氧，2 h后按缺氧组方法取材固定。各组随机选取4只胎鼠的大脑组织作经常规石蜡切片（冠状切面，片厚4 μm）、再进行免疫组化染色、显微镜下以脑室系统周围为观察对象、照相、图像分析。

　　3 结果

对照组Nestin免疫组化反应阳性细胞胞质染为棕黄色，部分细胞有细而短的突起。阳性细胞呈区域性分布，主要集中在胚胎发育的中轴部位如：侧脑室、第三脑室、中央导水管和第四脑室的室管膜上皮层和室管膜下区，室管膜上皮层多表现为复层上皮样排列（见图1）。

　　缺氧组Nestin免疫组化反应阳性细胞的分布与对照组相似，但与对照组相比：除缺氧12 h组以外，其余各缺氧组阳性细胞染色增强，数量增多，而且有突起的细胞增多，突起变长，其积分光密度值（IOD）均增大；而缺氧12 h组的阳性细胞染色较对照组明显减弱，数量减少。各缺氧组间比较：缺氧6 h组较缺氧3 h组阳性细胞染色增强，数量增加，缺氧9 h组较缺氧6 h组阳性细胞染色减弱，数量减少（见图2～5）。

　　当归治疗组Nestin阳性细胞的分布与对照组相似，与缺氧组相比：除当归治疗12h组外，其余各治疗组阳性细胞染色较相应缺氧组减弱，数量减少，有突起的细胞减少，突起变短（见图6～9），其IOD值均减小（P＜0.05）。见表1。当归治疗12 h组阳性细胞染色与缺氧12 h组无统计学差异（P＞0.05）。表1 各组Nestin免疫组化阳性细胞IOD值(略)