塞来昔布对糖尿病大鼠视网膜凋亡抑制蛋白Bcl?2表达的影响(一)
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【摘要】 目的：探讨塞来昔布对糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠凋亡抑制蛋白Bcl?2表达的影响。方法：将40只Wistar大鼠用链脲佐菌素(STZ) ip制成DM大鼠模型,随机分成DM 组(n=20)和塞来昔布灌胃(celecoxib group，Cel)组(n=20)。另10只正常大鼠为正常对照组(contrast group, Con)。3mo后处死全部大鼠,制备大鼠视网膜石蜡切片,应用免疫组化法及HP IAS?1000型高清晰度彩色病理图文分析系统观测大鼠视网膜Bcl?2的表达。结果：Con组Bcl?2反应阳性弱,表达量低; DM组Bcl?2反应呈强阳性,表达增高(P0.01) ;Cel组Bcl?2反应阳性减弱,表达降低 (P0.01)。结论：Cel能够减少STZ诱导的DM大鼠视网膜凋亡抑制Bcl?2蛋白表达。
【关键词】 糖尿病视网膜病变;凋亡抑制蛋白Bcl?2;塞来昔布
Correspondence to:Zhan?Yu Zhou.Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province,China.zhouzhanyu1125@163.
Abstract
をMETHODS: Forty Wistar rats were used to establish diabetic models by intraperitoneal injecting with streptozotocin, and divided into diabetes mellitus group (n=20) and celecoxib group (n=20), ten else rats were in normal control group. All of the rats were executed 3 months later. Immunohistochemistry and puter?picture analytic system were used to observe the expression of Bcl?2 protein in retinas of rats.
をRESULTS: The expression of Bcl?2 in normal group was higher than that of celecoxib group and lower than that of diabetes mellitus group(all P0.01
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常见和严重的眼部并发症,已成为目前世界上主要的致盲眼病之一,早期预防和治疗DR是当前眼科领域攻关的重要课题。视网膜新生血管的出现是DR最早出现的特异性改变，视网膜新生血管通常由视网膜毛细血管周细胞凋亡抑制所致。已有充分研究表明，在DM 大鼠视网膜中COX?2表达含量常显著增高[1]。实验证明，塞来昔布(celecoxib，Cel)作为新型的特异性 COX?2抑制剂,通过抑制 COX?2的活性抑制视网膜 VEGFmRNA的表达,引起视网膜细胞合成 VEGF蛋白减少[2]。血管内皮生长因子(VEGF) 是内皮细胞(endothelial cell, EC)的存活因子,它阻止了缺血诱导的细胞凋亡并且能诱导 EC表达凋亡抑制蛋白Bcl?2，从而参与毛细血管的凋亡过程DR病理变化,并在视网膜新生血管的发生发展过程中起着重要作用。利用选择性的 COX?2抑制剂可使 VEGF和bFGF等多种促血管生成因子的表达降低，下调凋亡抑制蛋白Bcl?2表达从而阻断这些模型中的新生血管生成。我们探讨选择性COX?2抑制剂?Cel对链脲佐菌素(STZ)诱导的早期DM大鼠视网膜中Bcl?2表达情况。应用免疫组化法及彩色病理图文分析系统观测在不同处理因素下DM大鼠视网膜Bcl?2的表达 ,以探讨Cel对DM大鼠视网膜凋亡蛋白Bcl?2表达的影响。
1材料和方法
1.1材料
健康成年无眼疾的Wistar大鼠40只由青岛大学医学院实验动物中心提供,雌雄不限，体质量210～320g。饲养于标准化饲养房。一次性ip STZ(德国Boehringer Mannheim公司) 55mg/kg。另10只大鼠分为正常对照组(contrast group, Con),每只ip等体积枸橼酸盐溶液。注射STZ 24～48h检测尿糖 (+++)以上、72h后取尾血测血糖≥16.7mmol/L者确定为DM大鼠。模型建立后每周监测1次定性尿糖、体质量、24h尿量和饮水量,每月检测1次血糖。DM大鼠随机分为DM组和Cel灌胃组，每组20只。DM模型建立2d后,Cel灌胃组大鼠经口灌胃Cel 50mg/kg, 2次/d,DM组灌胃等体积生理盐水。各组大鼠单笼喂养,自由进食、饮水。饲养3mo。除去死亡及血糖恢复正常大鼠,最终每组15只入组。图1Bcl?2凋亡抑制蛋白的表达 A：Con组;B：DM组;C：Cel组。
1.2方法
喂养3mo末,以过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,轻摘左眼球,放入预先配置的40g/L中性甲醛溶液中。将各组大鼠的右侧眼球,也固定于40g/L多聚甲醛液中(4℃,12h)。于锯齿缘后0.15mm处剪开眼球壁,去除眼前节和玻璃体,余下的眼杯进行全层石蜡包埋,制作5～7μm切片。以微波处理10min (95℃);30mL/L H2O2?700mL/L甲醇室温处理30min;30mL/L正常小牛血清室温孵育30min;抗Bcl?2抗体即一抗(Santa Cruz,USA,为多克隆抗体,浓度各为1∶150),湿盒内4℃孵育20h;生物素标记的羊抗兔血清即二抗(Vector Laboratory,USA) 1∶200,湿盒内37℃孵育1h;卵白素2生物素即ABC复合物(Vector Laboratory,USA)湿盒内于37℃孵育1h; DAB呈色,显微镜下监视反应,约10min,以蒸馏水停止反应。苏木素复染梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。阴性对照:以正常小牛血清代替一抗,其余步骤同上。随机选取Con和Cel及DM各组视网膜切片3张,每张切片随机取5个视野,应用HP IAS?1000型图像分析系统测定 Bcl?2在视网膜血管的免疫反应强度(平均黑度)计算阳性信号平均灰度值,用阳性产物的灰度值来表示免疫反应表达程度。统计学分析:采用统计学软件包SPS 13.0。所测数据行方差分析和q检验。P0.05为差异有统计学意义。
2结果
在Con组Bcl?2阳性反应仅出现于节细胞层、内网层、内核层和外网层的血管,反应较弱多呈浅棕黄色; DM组除血管的阳性染色加深外色素上皮细胞亦出现强阳性反应,呈深棕黄色;而Cel灌胃组 Bcl?2免疫阳性仅见神经节细胞胞质中,阳性细胞数明显少于 DM组,且较正常对照组减少(图1)。大鼠视网膜血管Bcl?2表达强度(灰度) Con组为138.8± 8.5, DM组 168.9±7.5,Cel灌胃组为 124.2±7.0。可见Cel使Bcl?2免疫阳性反应明显减低 (q=17.5002,P0.01) ; DM组较Con组则明显增高 (q=25.9887,P0.01)。
3讨论
DR是糖尿病的主要并发症之一,几乎所有DM病程达10a以上的患者均出现一定程度的DR，也是成人失明的主要原因之一。DM可引起视网膜缺氧 ,视网膜感光层受损[3]。其中因毛细血管周细胞丧失而最终形成视网膜新生血管是DR最早出现的特征性改变，其性质为细胞凋亡。对动物模型的研究可以观察不同病程的细胞凋亡情况,周细胞的凋亡，这可能是引起新生血管形成和增生性糖尿病视网膜病变的重要因素之一。在DR早期通过各种相关的抑制因素使细胞凋亡得到控制,也就意味着从根本上控制了DR的发生和发展。因此对有关抑制细胞凋亡的基因、各种因子以及药物的研究也就成了热点课题。目前为止发现多种与凋亡有关的基因,并将其分为两大类:生存基因和凋亡基因。Bc1?2基因是凋亡基因最具代表的一种,在细胞凋亡中所起的作用较为肯定。体外实验显示Bcl?2抑制凋亡的发生,研究证明Bax是Bcl?2的同种性蛋白,在细胞凋亡中所起的作用却相反。两种基因之间的比例决定了细胞的命运是生存还是凋亡。生存基因中最具代表性的为Bcl?2。Bcl?2基因首先在人淋巴细胞瘤转位上发现,随后的研究表明是正常的细胞调节基因,在神经细胞等正常组织细胞中广泛表达。基因编码的蛋白质属膜蛋白26kD主要位于核膜、线粒体膜及内质网膜上。在细胞凋亡中所起的作用较为肯定,体外实验显示,Bcl?2抑制凋亡的发生。它通过阻断细胞凋亡信号传导系统的最后共同通路而抑制凋亡,从而避免细胞死亡。它对视网膜周细胞和内皮细胞的凋亡抑制作用已在动物实验中得到证实。