宁夏回族高脂血症患者CYP2C9*3、MSA2756G基因多态性的研究(一)

详细内容

作者：李居怡，金晶，高鹏，杜娟，王健

【摘要】 目的 研究高脂血症治疗的药物相关基因CYP2C9*3、甲硫氨酸合成酶(MSA2756G)在宁夏回族高脂血症患者中的分布及其与高脂血症的关系。方法 通过扩增引进限制性酶切位点(ACRS)和应用聚合酶链式反应?限制性片段长度多态性(PCR?RFLP)技术对高脂血症患者进行基因型分析。结果 180名宁夏回族高脂血症患者中，CYP2C9*3等位基因频率为3.33%，突变频率男性(3.05%)高于女性(0.28%)，差异有显著性(P0.01)，而与健康对照组(3.00%)比较，差异无显著性(P>0.05);MSA2756G等位基因频率为15.83%，显著高于健康对照组(10.25%)(P0.05)，未发现性别差异。结论 宁夏回族人群携带CYP2C9*3基因型的男性患高脂血症风险更大;MSA2756G可能是高脂血症的危险因子。

【关键词】 高脂血症;CYP2C9;甲硫氨酸合成酶;多态性;宁夏回族

　　ABSTRACT: Objective To investigate the distribution of CYP2C9*3 and methionine synthetase (MSA2756G) genes related to drug therapy in hyperlipidemia patients of Ningxia region as well as its relation with hyperlipidemia.Methods Genotype was determined by using amplication?created restriction sites (ACRS) and polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphism (PCR?RFLP) in hyperlipidemia patients.Results Among the 180 hyperlipidemia patients of Ningxia Hui population, the frequency of CYP2C9*3 alleles was 3.33% and mutation rate in men (3.05%) was significantly higher than that in women (0.28%) (P0.01). However, the indexes mentioned above did not differ from those of the healthy controls (3.00%) (P>0.05). The frequency of MSA2756G (15.83%) alleles was significantly higher than that in healthy control group (10.25%) (P0.05), but there was no difference between men and women.Conclusion Men in Ningxia region who carry CYP2C9*3 genotype have a higher risk of hyperlipidemia; MSA2756G mutation may be a risk factor for hyperlipidemia.

　　KEY WORDS: hyperlipidemia; CYP2C9; methionine synthase; polymorphism; Ningxia Hui population

　　高脂血症是促进动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要危险因素之一。合理的药物治疗能有效降低血脂，从而减少冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生概率。他汀类药物是新一代最有效的调血脂药[1]。据美国食品药品管理局数据显示，氟伐他汀是他汀类中毒事件发生最少的药物，其主要经肝脏细胞色素CYP2C9代谢清除，而基因突变可能会影响肝药酶的活性[2]。因此，CYP2C9基因多态性可能与高脂血症的发生有关。甲硫氨酸合成酶(MS)是同型半胱氨酸(homocysteine)再甲基化代谢途径的关键酶，而Hcy使机体产生高脂血症，可导致代谢疾病的发生，造成动脉粥样硬化[3]。因此，MS基因多态性有可能是高脂血症的危险因子。本研究旨在探讨宁夏回族人群CYP2C9*3、MSA2756G基因多态性分布及其与高脂血症的发生有无关联性。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象 2007年1月至10月在宁夏回族自治区人民医院体检的健康回族志愿者200例，其中，男性100例，女性100例，年龄在(46.22±9.25)岁之间，体重指数在(25.22±3.99)kg/m2之间;高脂血症患者180例，其中，男性92例，女性88例，年龄在(45.06±8.96)岁之间，体重指数为(24.99±3.06)kg/m2之间，无其他内分泌疾病。高脂血症的诊断标准为：空腹血清中总胆固醇(TC)≥5.72mmol/L，甘油三酯(TG)

　　≥1.70mmol/L，受试者了解试验过程并签署知情同意书。

　　1.2 DNA样品的制备 抽取每位受试者静脉血3mL，采用北京赛百盛生物公司的硅胶膜基因组提取试剂盒提取基因组DNA。

　　1.3 基因型的检测 采用扩增引进限制性酶切位点(ACRS)和聚合酶链式反应?限制性片段长度多态性(PCR?RFLP)技术检测CYP2C9*3和MSA2756G的多态性分布;直接测序法验证基因型检测方法的可靠性。①CYP2C9*3引物[4]序列：上游5＇?TGCAC?

　　GAGGTAGAGGTAC?3＇，下游5＇?AAACATGGAGTTGCAGTGTAG?3＇，扩增产物为131bp，扩增循环参数：反应体系25μL，94℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火60s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃再延伸5min，PCR扩增产物用5u限制性内切酶KpnⅠ在37℃消化过夜，40g/L琼脂糖凝胶电泳确定基因型。基因型的判定方法：如酶切图谱显示为131bp一条带，则为CYP2C9*1*1野生型，如为131bp、110bp的条带(21bp的条带在40g/L的琼脂糖凝胶上不能被辨认)，则为CYP2C9*1*3突变型杂合子，如仅显示110bp条带(21bp的条带在40g/L的琼脂糖凝胶上不能被辨认，仅见110bp的条带)，则为CYP2C9*3*3突变型纯合子。②MSA2756G引物[5]序列：上游5＇?CATGGAAGAA?

　　TATGAAGATATTAGAC?3＇、下游引物：5＇?GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA?3＇，扩增产物为189bp，扩增循环参数：反应体系25μL，94℃预变性5min，94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃再延伸7min，PCR扩增产物用10u限制性内切酶HaeⅢ在37℃消化过夜，40g/L琼脂糖凝胶电泳确定基因型。基因型的判定方法：如酶切图显示为189bp一条带，则为AA野生型，如为189bp、159bp的条带(30bp的条带在40g/L的琼脂糖凝胶上不能被辨认)，则为AG突变型杂合子，如仅见159bp条带(30bp的条带在40g/L的琼脂糖凝胶上不能被辨认，仅见159bp的条带)，则为GG突变型纯合子。

　　1.4 统计学处理 计数各位点基因型频率和等位基因频率，采用SPSS 11.5统计软件分析，以χ2检验检测高脂血症患者与正常人群及男女性别之间的各等位基因频率的差异，高脂血症患者与正常人群年龄、体重间的比较采用t检验，以P0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 基因型和等位基因的分布 本研究所筛选符合条件的高脂血症患者180例和正常对照组200例在性别、体重、年龄之间均无显著性差异(P>0.05)，具有可比性(表1);凝胶电泳图和测序图见图1、2，CYP2C9*3、MSA2756G等位基因的分布频率在高脂血症组分别为3.33%、15.83%(表2)。第5个碱基处有A、G重峰，碱基A比突变碱基G峰的信号强而显示绿色碱基A(图2C);被圈的碱基G，表示上游引物中引入错配碱基G成功(图2D、图2E)，而倒数第二个碱基显示为A，碱基A比突变碱基C峰的信号要强,而显示绿色碱基A。　表1 宁夏回族高脂血症患者与健康对照组基本情况的比较

　　2.2 各基因型与高脂血症的关系 在高脂血症患者组，CYP2C9*3的等位基因分布频率显示男性显著高于女性(3.05% vs. 0.28%)(P0.01)，而CYP2C9*3等位基因分布频率在高脂血症患者组与健康对照组之

　　间无显著性差异(3.33% vs. 3.00%)(P>0.05)，CYP2C9*3与高脂血症无显著相关性;高脂血症患者组的MSA2756G等位基因分布频率显著高于健康对照组(15.83% vs. 10.25%)(P0.05)，差异有统计学意义，MSA2756G等位基因与高脂血症有显著相关性;CYP2C9*3、MSA2756G之间的联合基因型在高脂血症患者组与健康对照组间经χ2检验，发现CYP2C9*3、MSA2756G联合基因型与高脂血症无关联性(P>0.05)。