靶向COX(一)

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作者：谯敏，向廷秀，王丕龙，黄爱龙

【关键词】 RNA干扰；环氧化酶

【Abstract】AIM: To investigate the inhibitory effect of siRNA targeting COX2 on the growth of gastric carcinoma cells of well, moderate or poor differentiation (MKN28, SGC7901, BGC823) and related mechanism. METHODS: siRNA targeting COX2 gene was designed, siRNACOX2 vector was constructed and transfected into gastric carcinoma cells to induce RNA interference. The changes of COX2 were detected with RTPCR and Western blotting.Cell viability was detected by MTT. Cell apoptosis was judged by TUNEL and electromicroscopy, and expressions of Bax and Bcl2 were tested by Western blot. RESULTS: Both COX2 expression and cell growth were inhibited in SGC7901 and BGC823 after transfection of siRNACOX2 vector into the cells. But, in MKN28 ,only COX2 expression decreased. The obvious cell apoptosis both in SGC7901 and BGC823 was observed. Bax was upregulated and Bcl2 was downregulated in SGC7901 and BGC823. In contrast, there were almost no changes in control group in vitro. CONCLUSION: RNA interference inhibits the growth of gastric carcinoma cells, which may be related to downregulation of COX2 and induction of cell apoptosis. The inhibitory effect of RNAi was relatively strong in SGC7901, which indicated that the effect of siRNA was dependent on the differentiation degree of gastric carcinoma cells.

【Keywords】 RNA interference; COX2; cell proliferation; apoptosis; stomach neoplasms

【摘要】目的： 利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术在体外抑制COX2表达，研究其抑制三种不同分化程度的胃癌细胞（MKN28，SGC7901，BGC823）的可能性，探讨RNAi抑制胃癌生长与胃癌细胞分化程度的相关性. 方法： 设计靶向COX2基因的siRNA，构建重组表达质粒pTZU6+1siRNACOX2并导入胃癌细胞株，体外诱导RNAi，采用逆转录PCR（RTPCR）和Western blotting检测COX2基因表达变化,MTT法检测细胞活力,原位末端标记（TUNEL）及透射电镜检测细胞凋亡，Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl2的改变. 结果： pTZU6+1siRNACOX2质粒导入细胞后，SGC7901和BGC823中COX2表达明显下调，细胞生长被抑制，并出现特征性的细胞凋亡，同时有Bax蛋白上调和Bcl2蛋白下调. 对照组则无明显变化. 结论： RNAi显著抑制胃癌细胞生长，可能与下调COX2基因表达和诱导细胞凋亡有关,其对中分化胃癌细胞的抑制作用最为显著，提示RNAi的作用可能依赖于胃癌细胞的分化程度.

【关键词】 RNA干扰；环氧化酶2；细胞增殖；细胞凋亡；胃肿瘤

环氧化酶（Cyclooxygenase, COX）是花生四烯酸(arachidonic acid, AA)合成前列腺素(prostaglandins，PGs)的限速酶，其有两种同工酶. COX1是在正常组织中表达的结构型酶；COX2是诱导型酶，正常生理状态下表达甚少，而在各种刺激因子存在时表达增加. 有研究表明，COX2在胃癌中高表达〔1〕. 我们依据RNA干扰（RNA interference, RNAi）原理，以真核表达质粒pTZU6+1为载体〔2〕，设计并构建靶向COX2基因的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), 作用于三种分化程度不同的胃癌细胞株，研究COX2基因特异的siRNA对胃癌细胞生长的抑制、可能的作用机制以及与胃癌细胞株分化程度的相关性，为COX2抑制剂应用于胃癌治疗提供理论基础.

1材料和方法

1.1材料中分化胃癌细胞株SGC7901和低分化胃癌细胞株BGC823细胞株由重庆医科大学病理生理学教研室提供；高分化胃癌细胞株MKN28细胞株购自上海消化疾病研究所；质粒pTZU6+1由重庆医科大学感染性疾病重点实验室黄爱龙教授惠赠；限制性内切酶XbaI, SalI, HindIII和EcoRI以及连接试剂盒购自美国TakaRa公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自美国Promega公司；总RNA提取试剂、RTPCR试剂盒购自美国Qiagen公司；转染试剂lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；COX2，Bax和Bcl2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；COX2引物和内参GAPDH引物以及siRNA转录模板由北京三博远志生物工程技术有限服务公司和大连宝生物公司合成.

1.2方法

1.2.1siRNA结构的设计和合成根据siRNA设计原则〔3〕和COX2编码序列，设计19nt的DNA片段，中间为4个碱基的与目的基因无同源性的插入序列(TTCG)，末端终止子为TTTTT，并利用BLAST进行查询，确定其为特异性序列. 合成的DNA两端设计有XhoI或XbaI酶切位点，便于与pTZU6＋1载体连接. 设计合成pTZU6+1siRNACOX2转录模板序列（正义：5＇ GTT CTCTAATCTT3＇，反义：5＇AGGAGA GGTTAGAGAAGGC 3＇）；相应合成的干扰序列（正义：5＇TCGAGGTTCTCTAATCTTTTCGAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT TT TT3＇）（反义：5＇CTGAGAAAAAAGTTCTCTAATCTTCGAAA GGAGAGGTTAGA GAAGG3＇）.

1.2.2重组载体siRNA的构建内切酶SalI和XbaI酶切转录载体pTZU6+1，然后与纯化的双链DNA片段在T4 DNA连接酶作用下，4℃连接过夜，转化大肠肝菌JM109，Amp抗性筛选. 筛选克隆提取DNA，用EcoRI和HindIII双酶切，并用相同的酶酶切载体pTZU6+1作为对照，琼脂糖凝胶电泳并测序鉴定. 构建的重组质粒命名为pTZU6+1siRNACOX2（简称siRNACOX2）.

1.2.3质粒转染细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液, 37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养. 转染时，将细胞消化、离心并重悬后稀释为1×109个/L，以2 mL/孔接种于6孔培养板中，置37℃培养过夜. 于次日用siRNACOX2分别转染三种细胞，同时设pTZU6+1空载体转染的阴性对照和只接种细胞，不作处理的空白对照. 在无血清、无抗生素的RPMI1640培养液培养4~6 h后换新鲜的含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液，继续培养2~4 d 后检测各指标.

1.2.4RT PCR检测COX2 mRNA采用RTPCR一步法试剂盒. 反应条件为50℃， 30 min，94℃ 5 min， 94℃ 55 s， 54℃ 55 s， 72℃ 55 s， 35循环. 以GAPDH作为内参，并设相应的阴性对照和空白对照. 扩增的COX2长度为270 bp，GAPDH长度为821 bp. 扩增产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳30 min，EB染色，用BIORAD图像分析仪上观察并扫描制片，记录结果.

1.2.5Western blotting检测COX2，Bax和Bcl2蛋白配制100 mg/L的SDSPAGE分离胶和50 mg/L的SDSPAGE浓缩胶. 收集对照组和转染siRNACOX2质粒48 h的三种细胞，沉淀用PBS洗2遍，细菌裂解液处理，混匀，上样10 μL，90 V恒压电泳约60 min，120 V恒压电泳约2 h，4℃，25 V恒压电转过夜. 次晨取出硝酸纤维素（NC）膜，1∶500稀释的一抗溶液，4℃过夜，1∶1000稀释的二抗溶液，37℃，轻轻振荡2 h后弃反应液. DAB染色试剂盒染色，BIORAD图像分析仪观察并扫描制片，记录结果.

1.2.6MTT法分别将对数生长期的三种细胞以5×107/L接种于96孔培养板中，每孔200 μL，常规培养24 h后加上处理因素，每组设4个复孔，并设阴性对照组. 继续培养1~ 4 d，每孔分别加入5 g/L的MTT 20 μL，37℃孵育 4 h后弃去上清，每孔均加入二甲基亚砜100 μL，轻微振荡使紫蓝色沉淀溶解. 用酶标仪测定A490 nm，计算每组细胞增殖的抑制率（IR）以及中效浓度. 并在倒置显微镜下观察各组细胞形态. IR=（l-试验孔A/对照组A）× 100%.

1.2.7TUNEL采用TUNEL反应检测试剂盒，分别取对数生长期的三种细胞4 ×105接种于6孔板，完全培养基培养过夜，分组转染细胞. 转染后72 h，弃上清，用950 mL/L乙醇固定，30 mL/L的H2O2封闭，1 mL/L Triton100,每孔加50 μL反应混合液,37℃孵育60 min,每孔加50 mL POD,最后用DAB显色. 同时设立阴性对照.

1.2.8电镜观察分别收集阴性对照和转染siRNACOX2质粒48 h的三种细胞，制成超薄切片，拘檬酸铅染色，透射电镜观察细胞超微结构的变化并摄片.

统计学处理： 数据均以x±s表示，采用SAS8.0统计软件进行数据处理，对所得的各组数据进行方差齐性检验，方差齐时用t检验对各组转染前后的差别进行探索性分析.