盐霉素高产菌的推理选育(一)
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【摘要】 根据盐霉素生物合成途径对其产生菌进行了推理选育。在常规诱变基础上选用丁酸作为筛选剂检出所需要的突变株，成功获得三株高产菌株3?233#、3?244#和3?250#，其效价比出发菌株F2?1#分别提高了34%、44.9%和39%。
【关键词】 盐霉素； 诱变剂； 筛选剂； 推理选育
Rational screening for high salinomycin?producing strain
Chu Xiao?he1,2, Wang Pu1 and Song You?li2
(1 College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032;
2 Zhejiang Shenghua Biok Biology Co., Ltd., Huzhou 313220)
ABSTRACT A salinomycin?producing strain, namely #F2?1, was treated and mutated using physical factor of UV and chemical factor of ethylmethane sulfonate (EMS) respectively with reference to the inferential screening theory. The positive mutants were obtained from the plates with butyric acid for screening. Three most stable and productive strains of #3?233, #3?244 and #3?250 were validated in 30 m3 fermentor. The results showed that the titres of mutant #3?233, #3?244 and #3?250 were 34%, 44.9% and 39% respecti?vely, and higher than that of the original strain #F2?1.
KEY WORDS Salinomycin; Mutagen; Screening reagent; Rational screening
盐霉素(salinomycin)是由白色链霉菌(Streptomyces albus)发酵产生〔1〕。日本早已证实盐霉素有很广的抗球虫谱，对鸡的柔嫩、毒害、堆型、脆弱、巨型和哈氏球虫均有效，50mg/kg就有明显抑制作用〔2，3〕。此外，盐霉素对大多数革兰阳性菌有抑制作用，对梭菌等革兰阳性厌氧菌也有较强的抑制作用〔4〕。盐霉素以其高效、低残留、低耐药性在世界几十个国家获得许可使用〔5〕。目前关于盐霉素的研究主要集中在其应用研究方面，对其菌种及工艺研究的报道较少。盐霉素为典型的含聚醚链(polyether chain)结构的抗生素，通过乙酸和丙二酸的缩合进行生物合成〔6，7〕。盐霉素为构成聚醚链的丙二酸被甲基和乙基高度取代的线性脂族分子，沿着分子链有一系列的四氢吡喃环和四氢呋喃环〔8〕。研究表明，盐霉素生物合成过程和其他聚醚系抗生物质相同， 即C2?C4的脂肪酸直接进入盐霉素合成，为6mol乙酸、6mol丙酸和3mol丁酸缩合而成(图1)，其中丁酸为合成启动子〔9〕。本文根据盐霉素分子结构和生物合成途径，运用推理选育理论，通过选用丁酸R=CH3，甲基盐霉素； R=H，盐霉素 作为筛选剂进行高产菌选育，为进一步工业化生产水平奠定基础。
1 材料与方法
1.1 出发菌株 盐霉素产生菌F2?1#由浙江升华拜克生物股份有限公司科研中心提供。
1.2 培养基
斜面培养基(g/L) 甘油18，酵母浸粉2.3，氯化钠1.9，硝酸钠1.1，琼脂22；pH自然。
摇瓶种子培养基(g/L) 蔗糖9.7，玉米浆25，磷酸二氢钾2.0，豆油3.4，轻质碳酸钙1.1，酵母膏粉0.2；pH6.7～6.8。
摇瓶发酵培养基(g/L) 葡萄糖5.0，棉籽饼粉5.0，黄豆粉5.0，酒石酸铵5.0，轻质碳酸钙5.0，氯化钾2.0，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁1.0，氯化钠0.1，豆油140；pH7.2。
种子罐培养基(g/L) 蔗糖15.0，棉籽饼粉8.0，黄豆粉7.0，酒石酸铵5.0，轻质碳酸钙5.0，氯化钾2.0，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁1.0，氯化钠0.3，豆油210；pH7.2。
发酵培养基(g/L) 葡萄糖25.0，棉籽饼粉15.0，黄豆粉15.0，酒石酸铵5.0，轻质碳酸钙6.5，氯化钾2.0，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁1.0，氯化钠0.3，豆油240；pH7.2。
1.3 实验方法
(1)紫外线(UV)诱变 刮取适量白色链霉菌的孢子于生理盐水中，振荡、打散孢子，经过滤制成单孢子悬液，取6～8ml单孢子悬浮液放入灭菌的9cm培养皿内，紫外灯下边搅拌边照射。紫外灯功率15W，照射时间分别为0、10、20、30和40s，照射距离为30cm。
(2)甲基磺酸乙酯(EMS)诱变 用pH7.2磷酸缓冲液制成孢子悬浮液，吸取8ml孢子悬浮液放入带盖易密封小瓶中待用。用吸球及移液管吸取0.5ml的10mol/L EMS原液放入10ml pH7.2的磷酸缓冲液中制成0.5mol/L EMS溶液，再从0.5mol/L EMS溶液中吸取2ml放入盛放8ml孢子悬浮液带盖小瓶中，密封，置30℃培养箱中，每隔3min振荡1次。分别取不同时间的处理液，稀释，涂布双碟，计算死亡率、变异率(甲基磺酸乙酯的诱变效果与溶液质量有关，而甲基磺酸乙酯不稳定，易发生水解作用而生成有毒而无诱变作用的化学物质，因此，其溶液需现配现用)。
(3)筛选方法 经紫外或EMS诱变处理后的孢子悬液经稀释后涂布于含一定浓度丁酸的平板中进行分离，再挑取单菌落制作小斜面，摇瓶培养验证效价。
(4)效价测定采用化学法〔10〕和高效液相色谱法。
在本试验范围内，经数据分析，高效液相色谱法(Y)与化学测定法(X)大致量的关系为：
Y=1.1074X-9.005 (R2=0.9718)
(5)发酵及分析 采用两级发酵。种子培养条件33℃，230r/min，培养28h左右，30吨大罐放大三罐批，接种量10%，在33℃，230r/min发酵113～116h。实验结果取3个重复的平均值。发酵液分析采用高效液相色谱分析〔11〕。
2 结果与讨论
2.1 盐霉素产生菌选育系谱
以F2?1#为出发菌株，经2轮紫外诱变加丁酸筛选得到2?21#菌株，2?21#再经EMS诱变和丁酸筛选得到3株高产菌株3?233#、3?244#和3?250#。经此过程处理后筛选得到的突变菌株2?21#、3?233#、3?244#和3?250#即可进行发酵产量试验。
2.2 紫外线与EMS对盐霉素菌株的诱变效应
在采用丁酸作为筛选剂进行推理选育前，首先考察常规诱变即紫外线EMS对菌株的效应。试验结果表明，盐霉素菌株经紫外照射时间20s后存活率在10%以下，照射40s致死率为97.5%。EMS单独处理盐霉素菌株18s致死率达98%。在同一剂量的情况下，EMS对盐霉素产生菌的诱变发生正变率大大高于负变率，但随着EMS剂量提高，盐霉素产生菌正变率也呈下降趋势，故本实验中EMS使用的剂量为1%。