海洋来源的口蛄虾生物碱的分离纯化和抗鼻咽癌作用研究(一)

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作者：叶才果，潘海燕，黄培春，何志巍

【摘要】 目的从海洋来源的口蛄虾中提取并纯化该生物碱，研究其抗鼻咽癌作用。方法系统溶剂法初步分离口蛄虾乙醇粗提物，大孔树脂HP20层析分离正丁醇洗脱的组分；对富含生物碱的组分合并后萃取总生物碱；自动层析仪纯化总生物碱，254 nm波长检测，手动收集洗脱液；质谱仪分析生物碱分子量；MTT方法检测药物对细胞的生长抑制率，绘制细胞生长曲线。结果大孔树脂HP20能非常有效地富集分离的生物碱，质谱分析纯化的生物碱D3分子量为234.33。分离纯化的生物碱对鼻咽癌细胞增殖具有明显的抑制作用。结论口蛄虾来源的生物碱分子量为234.33，对鼻咽癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，并呈时间-剂量关系。

【关键词】 口蛄虾； 生物碱； 鼻咽癌； 纯化

　　Abstract：ObjectiveTo extract effective alkaloid from marine Oratosquilla materials and to study its effect on Nasopharyngeal Carcinoma cell proliferation and purify.MethodsEthanol extract from marine Oratosquilla was diluted by system solvent. Macroporous absorption resin HP20 column chromatography was used to separate n-Butanol diluted group and total alkaloids were extracted. Auto-chromatography was employed to purify alkaloid. The purified alkaloid molecular weight was analyzed by Mass Spectrometry. MTT method was employed to investigate the inhibitory rate on cells proliferation, and growth curves were protrated at the same time. ResultsAlkaloids were mainly segregated in HP20 chromatographic diluted groups. Purified alkaloid D3 was obtained through Auto-chromatography method. Molecular weight of the purified alkaloid was 234.33 by Mass Spectrometry technique. The alkaloid D3 had obvious inhibitory effects against both E1 and E-2Z cells.ConclusionThe marine-derived alkaloid D3 has prominent anti-cancer cell proliferation effects in a time- and dose- manners, and its molecular weight is 234.33.

　　Key words：Oratosquilla； Alkaloid； Nasopharyngeal carcinoma； Purification

　　本研究所利用鼻咽癌细胞株对一批海洋生物进行药物活性筛选，发现了一些具有抑制鼻咽癌细胞系增殖，同时也可以抗EB病毒(Epstein-Barr Virus)增殖的海洋生物〔1，2〕，其中口蛄虾乙醇粗提物抑制效果最明显，并申请了中国发明专利(专利号：ZL 99102633.0)。我们以往的实验证实口蛄虾单次乙醇提取物能显著抑制人鼻咽癌细胞系E1、E-2Z的DNA合成，降低细胞活性和细胞集落形成能力（周鸿科.《海洋生物1号对人鼻咽癌细胞系E-2Z生长的影响及其机制的研究》.2003,广东医学院硕士学位论文）。动物实验证明乙醇粗提物能抑制人低分化鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的生长和转移（顾帝水.《海洋生物1号对人鼻咽癌细胞系E-2Z转移特性及其裸鼠转移瘤的影响》.2004,广东医学院硕士学位论文）。本实验在进一步对活性组分分离纯化的基础上，结合前期的实验基础，确定活性物质的种类和分子信息正是本研究要解决的问题，以期为进一步将其开发成为有效治疗鼻咽癌的新药建立可靠的实验基础和依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞培养和药物筛选 E1和E-2Z鼻咽癌细胞系用含10%小牛血清的细胞培养液RPMI-1640常规培养(37℃，5％CO2)。取对数生长期，生长状态好的细胞用于实验。细胞接种于96孔培养板，每孔200 μl，1×104个细胞。设置4个药物浓度，分别为50，100，200，400 μg/ml，含DMSO(0.1％)的生长液为阴性对照，40 μg/ml 5-Fu作阳性对照。具体操作和检测参考文献〔3〕方法。

　　1.2 生物碱分离纯化 采用95％食用乙醇冷浸渍法从口蛄虾中得到乙醇粗提物〔4〕。经过系统溶剂法初步分离，大孔树脂HP20层析进一步分离、合并得到总生物碱，称为D，显色方法见文献〔5〕。自动层析仪SHQT-6A纯化总生物碱，得组份D1～D4，纯化后得生物碱D3。

　　1.3 生物碱质谱分析 用分析纯的甲醇溶解配制成1 mg/ml的液体，混悬振荡器振荡10 min，然后12 000 r/min高速离心。上清液用液相色谱－质谱联用仪岛津DP8080α分析。

　　1.4 统计学分析 实验数据资料均用±s表示，采用统计学软件SAS 8.0进行统计学分析。分别选用直线回归法、重复测量资料的方差分析和单因素方差分析方法。