天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响(一)

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【摘要】 【目的】研究天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠（SHR）心肌纤维化的影响及可能的作用机制。 【方法】将24只8周龄SHR随机分成3组：即天麻钩藤饮组（剂量为20g/kg）、卡托普利阳性对照组（剂量为100mg/kg）及高血压模型组(SHR组)，并设正常对照组（同周龄正常血压大鼠8只），实验期24周。比较各组收缩压、左室质量（mLV）及左室质量指数（wLV）、心肌胶原含量，并采用逆转录-聚合酶链反应（RT?PCR）方法检测心肌胰岛素样生长因子?1（IGF?1）的表达。【结果】天麻钩藤饮可显著降低SHR收缩压、mLV及wLV、心肌胶原含量及心肌组织中IGF?1表达水平（P＜0.01）。【结论】天麻钩藤饮可降低血压，抑制左室肥厚及心肌纤维化，其机制可能与减少心肌组织IGF?1表达有关。

【关键词】 天麻钩藤饮/药理学； 高血压/中药疗法； 心肌纤维化； 疾病模型，动物； 大鼠

心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是高血压病引起的主要心脏病理改变，也是导致心力衰竭、心肌梗死以及心律失常甚至猝死发生的重要原因之一〔1〕。因此，研究抑制和逆转心肌纤维化具有重要的意义。随着研究的深入，中医药干预高血压心肌纤维化取得了较好的疗效〔2〕。本实验观察了天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠(SHR)心肌纤维化的影响并探讨其可能的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 自发性高血压大鼠（SHR）24只、正常血压大鼠（WKY）8只，均为雄性8周龄，体质量200～240g，由中国科学院上海实验动物中心提供，合格证号：SCXK（沪）2003?0003。饲养于广州中医药大学第一附属医院清洁级动物房，用标准鼠料喂养。

1.2 药物

1.2.1 天麻钩藤饮的制备 药物组成：天麻9g，钩藤（后下）12g，石决明（先煎）18g，山栀9g，黄芩9g，川牛膝12g，杜仲9g，益母草9g，桑寄生9g，夜交藤9g，茯苓9g。所有药物均由广州中医药大学第一附属医院中药房鉴定为正品。制备方法：清水冲洗后浸泡40min，常规煎煮2次，第1次1.5h，第2次1h，合并2次滤液，80℃蒸气浓缩至含生药2g/mL，4℃保存备用。

1.2.2 卡托普利药液的制备 卡托普利（常州制药厂有限公司生产，批号：0311231）研磨成粉，双蒸水溶解，制备成含生药10mg/mL的药液，4℃保存备用。

1.3 试剂 心肌组织羟脯氨酸检测试剂盒（样本碱水解法）由南京建成生物工程研究所提供； Trizol核酸提取液为Gibco BRL公司产品；DNA分子量标准（Marker）为100 bp DNA Ladder，由大连宝生物有限公司生产；逆转录-聚合酶链反应（RT?PCR）试剂盒由大连宝生物有限公司生产；胰岛素样生长因子?1（IGF?1）及β?actin引物由上海生物工程公司合成。

1.4 仪器 RBP?1大鼠血压仪（中日友好医院）；Libroraen?210型分析天平（日本）；UV?754分光光度计（上海第三分析仪器厂）；Universal 30RF高速低温离心机（德国）；Gene Quant Ⅱ型DNA/RNA纯度测定仪（Pharmacia 产品）；PE9600基因扩增仪（美国）；PAC3000型电泳仪（Bio?Rad产品）；凝胶摄像及图像分析系统（Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software Version 2.0.3）。

1.5 分组与给药 将大鼠随机分为正常对照组（WKY大鼠）、天麻钩藤饮组（剂量为20g/kg）、卡托普利组（剂量为100mg/kg）和SHR组，每组8只，后3组均选用SHR大鼠。正常对照组和SHR组给予等容积蒸馏水，每日1次，共灌胃给药24周。

1.6 检测指标

1.6.1 收缩压（pSB）的测量 采用尾袖法，测定大鼠清醒状态下的尾动脉收缩压，按照血压仪说明书操作，连续测量3次，取平均值。

1.6.2 心脏质量、左心室质量和左心室质量指数的检测 实验结束时大鼠称体质量（mbody）后处死，取出心脏，以4℃预冷生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称取心脏质量；沿房室交界剪去心房和右心室，称取剩余的左心室质量（mLV），并计算左心室质量指数：wLV=mLV/mbody。

1.6.3 胶原含量（wC） 分别称取左室游离壁约50～80mg湿重的心肌组织，用碱水解法测定心肌羟脯氨酸浓度（HC），乘以8.2，算出胶原含量。

1.6.4 心肌组织内IGF?1表达检测

1.6.4.1引物序列设计〔3〕 IGF?1 PCR产物长度152bp：上游：5??GAGAGGGGCTTTTAC?3?，下游：5??TGCTTTTGTAGGCTTCAGTGG?3?；β?actin PCR产物长度310bp：上游：5??GAGCACTGTG

CTGCTCACTAGG?3?，下游：5?┣TGGTGGTG

AAGCTGTAGACTCT?3?。

1.6.4.2总RNA提取 取-70℃冻存心肌组织置直径为6.5cm的小陶瓷研钵中，加液氮将组织研成粉末状，再按1∶10比例加入Trizol核酸提取液，继续研磨（在冰浴下操作）制成匀浆。按操作说明提取总RNA，测定其纯度和含量。提取的总RNA D260/D280在1.7～2.0之间，纯度＞80%。

1.6.4.3逆转录（RT） 在10μL反应体系中，依次加入MgCl2 2μL，10倍PCR Buffer 1μL，4种脱氧核苷酸混合物（dNTP Mixture，各10mmol/L）1μL，Oligo dT?Adaptor Primer 0.5μL，总RNA 1μg，RNase Inhibitor 0.25μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5μL，RNase Free dH2O补足至总体积10μL，混匀，短暂离心。RT条件：50℃、30min→99℃、5min→5℃、5min。反应完成后，取RT产物置-30℃保存。

1.6.4.4聚合酶链反应（PCR） 取200μL EP管，按以下顺序加入各试剂：RT产物 10μL，5倍PCR Buffer 10μL，上游特异性引物0.5μL，下游特异性引物 0.5μL，TaKaRa Ex TagTM HS 0.25μL，RNase Free dH2O 28.75μL，共50μL。轻轻混匀，短暂离心。PCR条件：94℃、2min（预变性）→ 94℃、2min（变性），55℃、1min（退火），72℃、1min（延伸），循环35次→ 72℃ 、7min（继续延伸）。

1.6.4.5检测 PCR产物琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，显示DNA条带，采用紫外检测器测定各组条带的D值，并以凝胶图像分析软件分析相对含量。

1.7 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件进行统计分析。