知柏地黄丸对瘦素诱导特发性性早熟模型小鼠的影响(一)
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作者：刘孟渊， 徐雯， 肖柳英， 韩超
【摘要】 【目的】观察知柏地黄丸对瘦素（Leptin）诱导的特发性中枢性性早熟（ICPP）模型小鼠的影响。【方法】选用18日龄BALB/c雌性小鼠，随机分为6组：正常对照组，ICPP模型组，知柏地黄丸高、低剂量组（剂量分别为101.4、50.7g・kg-1・d-1)，甲地孕酮对照组（剂量为3.9mg・kg-1・d-1），促性腺激素释放激素类似物（GnRH?A）组（首次剂量为1 573.5μg/kg，第2、3次剂量均为1 180 μg/kg,隔日1次；除正常对照组外，其他各组均腹腔注射Leptin(20mg/kg)复制模型；检测各组小鼠阴道开口数，体质量，子宫、卵巢质量及血清黄体生成素（LH），雌二醇（E2）含量，并计算子宫与卵巢指数。【结果】知柏地黄丸高剂量组于造模第4～6天对leptin所致阴道开口提前有抑制作用（均P＜0.05或P＜0.01）；知柏地黄丸低剂量组可降低模型小鼠的子宫质量，抑制Leptin所致子宫指数与卵巢指数升高（均P＜0.05或P＜0.01）；知柏地黄丸高、低剂量组可降低模型小鼠的LH水平（均P＜0.01），但对模型小鼠的体质量及血清E2水平无显著影响（均P＞0.05）。【结论】知柏地黄丸治疗ICPP的作用可能与其能抑制下丘脑―垂体―性腺轴的提前发动有关。
【关键词】 知柏地黄丸/药理学； 性早熟/中药疗法； 黄体生成素/血液； 雌二醇/血液； 疾病模型，动物； 小鼠
性早熟是一种生长发育异常，表现为青春期特征提前出现。性早熟以女童为多见，其中特发性中枢性性早熟（ICPP）占女孩性早熟的80%～90%，男童性早熟的40%，ICPP的发病机理尚未完全清楚，可能系下丘脑―垂体―性腺轴（HPGA）功能的提前发动所致。由于其确切原因未明，因而无法复制出理想的ICPP动物模型。一般认为青春期的发动需要一定体质量和体脂的积累，瘦素（Leptin）可能涉及获得临界体脂总量的神经内分泌通道的信号作用，这可能是青春期启动的一个允许因子〔1〕。本实验拟采用Leptin刺激未成熟雌性BALB/c小鼠诱导ICPP动物模型，观察知柏地黄丸对抗ICPP的作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物 选用18日龄BALB/c雌性小鼠61只，由中国医学科学院上海实验动物中心提供（合格证号：中科动管会第001号），常规分笼饲养，自然照明，随意取食和饮水。
1.2 主要药物、试剂与仪器 知柏地黄丸由知母、黄柏、熟地黄、山萸肉、牡丹皮、淮山药、茯苓、泽泻等中药组成，所有灌胃中药均选用购自广东一方药厂生产的颗粒剂，用蒸馏水溶解，密封蒸浴加热消毒；醋酸甲地孕酮片由上海信谊康捷药业有限公司生产，批号：030101；抑那通针剂由日本武田药品工业株式会社生产，批号：368；Leptin购自Pepro Tech公司；雌二醇（E2）、黄体生成素（LH）检测试剂盒购自DR lab.California USA；Mettler Toledo 电子天平（1/1000）；贝克曼GS?15R台式冷冻高速离心机；Clinic Bio 128C酶标仪。
1.3 动物分组、造模〔2〕与给药 选用18 日龄BALB/c雌性小鼠61只，常规分笼饲养，自然照明，随意取食和饮水。19 日龄时称体质量，随机分为6组；正常对照组，ICPP模型组，知柏地黄丸高、低剂量组，甲地孕酮对照组，促性腺激素释放激素类似物（GnRH?A）组；20日龄时开始造模给药。正常对照组给予生理盐水腹腔注射（i.p），同时给予蒸馏水灌胃（i.g）；其他各组均腹腔注射Leptin(2mg/kg)复制模型，同时，知柏地黄丸高、低剂量组分别给予101.4、50.7g・kg-1・d-1剂量的知柏地黄丸药液i.g，甲地孕酮对照组给予甲地孕酮药液（剂量为3.9mg・kg-1・d-1)，均为上午给药，连续7d；此外，GnRH?A组给予GnRH?A制剂即注射用醋酸亮丙瑞林（商品名抑那通），在造模同时以抑那通于右后肢处肌注，隔日1次，首次给药剂量为1 573.5μg/kg，第2、3次给药剂量为1 180 μg/kg，共给药3次。
1.4 观察指标及方法
1.4.1 阴道开口 据预试验观察正常BALB/c雌性小鼠阴道开口时间一般在日龄26～28d，以27d较为集中。本实验于造模后第3天（即22日龄）开始每天下午4点观察各组阴道开口，26日龄时结束。
1.4.2 体质量变化 每天记录各组小鼠体质量变化，实验结束时，取前后体质量进行比较。
1.4.3 血清黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）含量测定 实验结束时，各组动物称体质量后，摘取眼球眼眶取血，3 500r/min、4℃离心15min，取上清，采用酶联免疫吸附法分别测定LH、E2含量。
1.4.4 子宫、卵巢质量 各组动物眼眶取血后，摘取子宫、卵巢分别称质量，计算脏器指数（w）：w=m脏器/mbody。
1.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件包进行数据处理，计数资料用列联表的Crosstabs过程进行统计学处理，计量资料采用独立样本t检验、及非参数统计的两独立样本秩和检验。
2 结果
2.1 各组小鼠阴道开口情况比较 各组小鼠开始出现阴道开口的天数及小鼠数见表1，正常对照组于造模第5天才有2/9小鼠出现阴道开口，阴道开口的平均天数是6.3d。ICPP模型组于造模第3天即有2/10小鼠出现阴道开口，阴道开口的平均天数是4.6d，比正常对照组提前1.7d（P＜0.05）。从造模第4天开始，ICPP模型组与正常对照组的阴道开口小鼠数比较出现差异，造模第4、5、7天，ICPP模型组小鼠的阴道开口较正常对照组提前（P＜0.05），提示Leptin可促进未成熟雌性小鼠阴道开口提前。
GnRH?A组于造模第3天即有4/10小鼠出现阴道开口，阴道开口的平均天数是3.1d，比正常对照组提前3.2d（P＜0.01），比ICPP模型组提前1.5d（P＞0.05）。造模第4～7天，GnRH?A组与正常对照组的阴道开口小鼠数比较，差异均有显著性意义（P＜0.05或P＜0.01），表明GnRH?A组小鼠阴道开口较正常对照组提前，尤其于造模第4、5天时，提示抑那通短期使用亦可能促进未成熟雌性小鼠阴道开口提前，并与Leptin有协同促进作用。
知柏地黄丸高剂量组于造模第5天才有2/11小鼠出现阴道开口，与模型组比较，于造模第4～6天对Leptin所致阴道开口提前均有抑制作用，尤以造模第5、6天抑制作用明显（P＜0.05或P＜0.01）；知柏地黄丸低剂量组及甲地孕酮对照组于造模第4天均有2/10小鼠出现阴道开口，与正常对照组比较，造模后不同时间点知柏地黄丸低剂量组及甲地孕酮对照组与正常对照组比较，阴道开口数之间差异均无显著性意义（P＞0.05），提示低剂量知柏地黄丸及作为临床使用的阳性对照药甲地孕酮，在本实验中对抗Leptin诱导的开口提前的作用不明显。 表1 各组小鼠阴道开口数比较
统计方法：用列联表分析的Crosstabs 过程进行计算；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，与正常对照组比较；③Ｐ＜０.０５，④Ｐ＜０.０１，与ICPP模型组比较
2.2 各组子宫、卵巢质量及体质量比较 表2结果显示，与正常对照组相比，ICPP模型组小鼠的子宫、卵巢质量有增加趋势，但两组差异无显著性意义（P＞0.05）；知柏地黄丸高剂量的子宫、卵巢质量较ICPP模型组均有降低趋势，但两组之间差异均无显著性意义（P＞0.05）。知柏地黄丸低剂量组子宫质量较ICPP模型组降低（P＜0.05），卵巢质量与ICPP模型比较差异无显著性意义（P＞0.05）；阳性对照药甲地孕酮能抑制Leptin 所致子宫质表2 各组子宫、卵巢质量及体质量比较统计方法：独立样本t检验；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，与正常对照组比较；③Ｐ＜０.００5，④Ｐ＜０.００１，与ICPP模型组比较
量的增加（P＜0.05），但对卵巢质量影响不明显（P＞0.05）。与正常对照组和ICPP模型组比较，GnRH?A 组小鼠子宫、卵巢质量均增加（P＜0.05或P＜0.01），尤以子宫质量增加显著（P＜0.01），提示抑那通可促进性腺生长，并与Leptin 具有协同促进作用。