六月青含药血清对HepG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的影响(一)

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作者：林兴　黄权芳　张士军　刘曦　黄仁彬

【摘要】 目的观察六月青（Liuyueqing，LYQ）含药血清的体外抗乙型肝炎病毒的作用。方法以MTT法检测药物在体外对HepG2.2.15细胞的生长抑制作用，采用酶联免疫法（ELISA法）检测HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg的滴度。结果LYQ含药血清对HepG2.2.15细胞50%生长抑制率的给药剂量为11.56 g・(kg・d)-1；而对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg 50%生长抑制率的给药剂量为0.178 g・ (kg・d)-1，其治疗指数（TI）为64.94；另外，LYQ含药血清对HBeAg抑制作用不明显。结论LYQ含药血清在体外有显著的抗HBV的作用，且毒性较低。

【关键词】 六月青含药血清； HepG2.2.15细胞； HBsAg； HBeAg

　　Abstract：ObjectiveTo observe the effect of the serum containing Liuyueqing (LYQ) on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells. MethodsThe toxicity of the serum containing LYQ on HepG2.2.15 cells was detected by means of MTT. The inhibitory effects of the serum containing LYQ on the excreation of HBsAg and HBeAg in HePG 2.2.15 cells were eva luated with method of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe dose which the serum containing LYQ could inhibit 50% HepG2.2.15 cells was 11.56 g. (kg.d)-1. The dose which the serum containing LYQ could inhibit 50% HBsAg was 0.178g. (kg.d)-1, and its treatment index (TI) on HBsAg was 64.94. The inhibitory effect of the serum containing LYQ on HBeAg was not obvious. ConclusionThe serum containing LYQ can inhibit HBV significantly in vitro， and it is a low toxic drug.

　　Key words：Serum containing Liuyueqing； HepG2.2.15 cell； HBsAg； HBeAg

六月青（Liuyueqing，LYQ）系爵床科（Acanthaceae）植物肖鸡笼（顶花马兰）Taraphochlamys affinis (Gr iff) Bremekhu (Strobilanthes affinis (Griff) Y.C.Tang)的干燥地上部分〔1〕。六月青是复方六月雪（CLYX）主要成分之一，本课题组前期研究表明，CLYX具有明显地抗HBV〔2，3〕和保护急性化学性肝损伤的作用〔4〕。本研究以转染有HBV DNA的HepG2.2.15为模型，采用中药血清药理学方法，观察LYQ含药血清对HepG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的影响，并初步探讨其作用机制，为筛选出复方六月雪中抗HBV主要活性部位提供实验依据。

　　1 材料

HBsAg（乙型肝炎表面抗原）和HBeAg（乙型肝炎E抗原）酶联免疫检测试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司）；HepG2.2.15细胞株，购自北京医科大学第一附属医院病毒研究所，本室自行传代，定期用G418（一种筛选抗生素）筛选；六月青水提物，由广西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心自行提取。阿昔洛韦（Aciclovir　ACV）：湖南迪诺制药有限公司医药工业研究所产品，批号: 20070518；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司，批号13200-035）；小牛血清（美国Gibco公司，批号16000-036）；G418（美国Sigma公司，批号108321-42）。

　　2 方法

　　2.1 LYQ含药血清的制备

　　3月龄Wistar大鼠70只，随机分为7组，每组10只。空白对照组：予等量的生理盐水；阳性对照组：ACV 1×10-4g・(kg・d)-1；LYQ1组：13.2 g・(kg・d)-1；LYQ2组：6.6 g・ (kg・d)-1；LYQ3组：3.3 g・(kg・d)-1；LYQ4组：1.7 g・(kg・d)-1；LYQ5组：0.9 g・(kg・d)-1。各组动物在同样条件下饲养，每日早晚各1次空腹灌胃给药，连续给药7 d。于末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12 h）后2 h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组动物的血清混合。经56℃ 30 min灭活处理，经0.45 μm的微孔滤膜，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，置-20℃冰箱保存备用。

　　2.2 LYQ含药血清的细胞毒性实验（MTT法）

　　取HepG 2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104 cell・ml-1，加入96孔培养板中（每孔100 μl），置CO2孵箱（37℃，5%CO2）中培养24 h后，细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液，加入上述含药血清100 μl，每个浓度设6个复孔。连续培养72 h，培养结束前4 h，每孔加入MTT 10 μl，于CO2孵箱中继续培养。4 h后小心吸弃上清液后，每孔加DMSO 100 μl，微量振荡器振荡5 min，使结晶紫完全溶解。自动酶标仪（检测波长570 nm，参考波长630 nm）读取各孔OD值，记录结果。按Reed-Muench法计算半数细胞毒浓度（TC50）和最大无毒浓度（TC0）。

　　2.3 ELISA法定量检测

　　HBsAg和HBeAg将2×104 cell・ml-1的细胞悬液加24孔细胞培养板，每孔0.5 ml，置CO2孵箱（37℃ 5%CO2）中培养24 h后，细胞贴壁且生长良好，除去全部培养液，根据细胞毒性试验结果，以1.7 g・(kg・d)-1给药剂量组的含药血清为第1个浓度，再用完全培养液系列2倍稀释成4个浓度的应用液，即相当于5个给药剂量级别：1.7，0.85，0.425，0.213，0.107 g・(kg・d)-1的含药血清，每孔加入上述各级别的含药血清应用液0.5 ml，每个浓度设3个复孔。连续培养72 h后，分别吸出上清液置于1.5 ml灭菌Eppendorf管中，-20℃保存，统一待检。

　　采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测，结果以抑制率表示，药物对抗原的抑制百分率（%）=〔1-实验孔抗原OD值/对照孔抗原OD值〕×100%，并按Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC50)。