时间分辨荧光法高通量筛选鱼肉组织中土霉素的残留量(一)

详细内容

【摘要】 目的 动物组织中抗生素残留量的测定一般需要多步骤的样品处理过程。本文介绍了一种全新的、简便和快速筛选鱼肉中土霉素残留量的方法。采用固相萃取和时间分辨荧光(time resolved luminescence，TRL)技术，无须离心和过滤，简化了分析过程。方法 将C18小片浸在组织匀浆液中提取和富集20min，取出，在水中浸泡3min，接着浸在TRL试剂溶液中2min，最后取出干燥。干燥后，在C18小片表面上直接进行荧光测定。结果 土霉素在0～8μg/g的范围内，仪器信号的响应与浓度呈现良好的线性关系(γ2=0.9992)，检测限为0.026μg/g，采用本法对45个加标准液的样品(浓度范围在0～4μg/g)进行分析，其中41个样品的定性结果正确，只有4个样品定性结果显假阳性。结论 本方法简便，快速，准确，适用于鱼肉组织中土霉素的高通量筛选分析。

【关键词】 时间分辨荧光； 筛选； 抗生素； 土霉素

ABSTRACT Objective Analysis of antibiotics in animal tissue matrices require multistep sample preparation. A new, easy and rapid method screening the oxytetracycline (OTC) in catfish is developed. It bines sorbent extraction and solid?matrix time?resolved luminescence (TRL) procedures. Without centrifugation and filtration, the analysis process get more easy and rapid. Method Extraction and enrichment are aomplished by immersing small C18 strips into tissues homogenates for 20 min, followed by a 3 min rinse in water and 2 min dip in a reagent solution. After desiation, TRL is measured directly on the C18 surface. Result The integrated TRL intensity shows a linear dependence on OTC concentration in the 0～8μg/g range (γ2=0.9992) with a 0.026μg/g limit of detection. Among 45 blind samples randomly fortified at 0～4μg/g, 41 were screened correctly and 4 negative samples were presumed positive only. Conclusion The method is simple, rapid and aurate and can be used for high throughout screening of OTC in tissue matrices.

KEY WORDS Time?resolved luminescence; Screening; Antibiotics; Oxytetracycline

土霉素(OTC)是水产养殖中治疗活性气单胞菌属败血症及假单胞菌属败血症的三种常用抗菌药物之一〔1〕，过度使用可引起土霉素在鱼体中的蓄积并导致细菌的耐药性。美国FDA规定用药后经过21d的消除期后最大残留限度为2ppm。目前，定量测定鱼肉中土霉素应用最多的是高效液相色谱方法， 通过紫外检测〔2〕、荧光检测〔3〕或质谱检测〔4〕进行测定。上述检测方法样品处理步骤繁锁(如匀浆，离心，过滤及固相萃取和净化等)，实验时间长，工作量大，难以用于大批量样品的检验。本文介绍的方法无须离心和过滤，大大简化了样品处理过程，可对大量样品首先进行筛选分析，再对疑似阳性的样品再进行定量分析。

1 仪器和试药

荧光检测仪(瓦里安，Walnut Creek，CA)型号：Cary Eclipse；数据采集及处理软件为Cary Eclipse Lifetime software；试剂及试药均为分析级，购自Aldrich(Milwaukee，WI)；去离子水处理系统为Barnstead E?pure system (Dubuque，IA)；匀浆机为Ultra?Turrax，Janke and Kunkel，Cincinnati，OH)；C18薄层板(200mm×50mm)：购自于Analtech(Newark，DE)，再将其分割为10mm×25mm的小片，然后除保留小片中间6mm×10mm的区域外，其余部分用刀片刮尽，处理后置于干燥箱中备用。土霉素储备液(1mg/ml于甲醇中，冰箱4℃保存)，临用前稀释；TRL试剂为0.5mmol/L Eu(NO3)3∶3.0mmol/L Na2EDTA∶2.5%(w/v)氯化十六烷基三甲基铵(CTAC)的0.15mol/L的tris缓冲液(pH8.5)。

2 实验步骤

2.1 提取和富集

取鱼肉(3.0±0.02)g置50ml聚丙烯离心管中，加入一定量的土霉素标准溶液至一定的浓度(如2ppm)，暗处放置10min，加入7ml的0.01mol/L Na2EDTA溶液后匀浆，再加入0.5ml的20%(w/v)氯化钠溶液，涡旋混匀。从干燥器中取出C18小板，先用少量甲醇润湿其表面，再用清水淋洗，在表面未干之前将其置于匀浆液中，20min后取出，浸没于清水中3min，取出。用纸在板的下边缘处吸去水滴。

2.2 测定

将上述C18小板浸入11ml的TRL试剂中，维持2min。取出后用纸在板的下边缘处吸去水滴，将C18小板置于密闭的干燥器内干燥约30min，直至观察到C18小板表面的颜色由暗转变为亮白色，最后把C18小板固定到样品支架上进行测定。激发和发射波长分别为388和615nm，延迟时间设定为10μs，对0.1～1.0ms之间的信号进行面积积分。