商品佛手和香椽rDNA ITS-RFLP鉴别研究(一)

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作者：高晓霞　陈晓颖　罗源生

【摘要】 目的:利用ITS-RFLP技术对佛手及其近缘种香橼的商品药材进行快速的分子鉴定。方法:限制性内切酶AluI和MspI分别对商品佛手和香橼的ITS1和ITS2目的片断进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。结果:5个商品佛手样品购自药材市场，ITS-RFLP酶切图谱显示可以对其进行分子鉴定。结论:利用ITS-RFLP方法可很好地快速区分佛手与香橼。

【关键词】 佛手;香橼;rDNA ITS序列;JTS-RFLP方法

　　本文将利用已建立的ITS-RFLP技术，对商品佛手和香橼进行RFLP分析，根据酶切后的电泳结果准确、快速地鉴别商品佛手。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　佛手与香橼新鲜植物材料由广东省中药研究所华南中药种植资源库于2005年4月28日提供。本研究中编号为S1-S5的5份佛手市售药材购自广州清平药材市场，经鉴定其中S1和S4为佛手（Citrus medical L.var.sarcodactylis（Noot.）Swingle），S2，S3和S5为香橼（C.medical L.）。

ExTag DNA聚合酶（TakaRa），琼脂糖（Promega），限制性内切酶Alul、Mspl（TaKaRa）。PE-480PCR扩增仪（PE），台式高速离心机（Sigma），恒压恒流电泳仪（Life Technologies），凝胶成像仪（Kodak EDAS120）。

1.2 方法

　　新鲜植物叶片各0.1g，采用改良的CTAB法提取总DNA〔1〕。PCR反应在20μL体系中含10×Buffer2μl，10mmol.L dNTP0.5μl，25mmol.L Mg2+ 2.4μL，10μmol.L引物各1μL，DMSO1μL，ExTaq（5U.μL）0.1μL，DNA模板（适宜浓度）2μL，灭菌三蒸水（3dH2 O）10μL。PCR扩增条件为94℃变性4min，94℃1min，50℃2min，72℃2min，循环30次;72℃延伸10min，以3dH2 O代替模板DNA作空白对照。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析。rDNA ITS区通用扩增引物18Sp48和26Se37由上海生工生物工程有限公司合成。18Sp48:5'-AGAAGTCGTAA-CAAGGTTTGTAGG-3';26Se37:5'-TTCTGCTTATT-GATATGC-3'。

RFLP分析中所用的限制性内切酶为AluI和Ms-pI。10μL反应体系，含10×Buffer1μL，限制性内切酶0.5μL，PCR纯化产物5μL，BSA1μL（如限制性内切酶buffer需要加BSA时），3dH2 O补足至10μL，37℃恒温水浴3～6h。取5～8μL用2%琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果，人工比较分析RFLP带型图谱。