缺氧诱导因子-1α在盐酸川芎嗪预处理的大鼠缺血再灌注脑组织中的表达水平研究(一)

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【摘要】 目的研究缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在缺血再灌注脑组织中的表达。方法应用Realtime PCR方法，对HIF-1α在盐酸川芎嗪预处理的大鼠缺血再灌注脑组织中的表达进行检测。结果缺血再灌注组、假手术组和用药组中HIF-1α的mRNA的表达无明显统计学差异。结论缺血缺氧并非在基因转录水平对脑组织HIF-1α的表达进行诱导。

【关键词】 缺氧诱导因子-1α 缺血再灌注 脑组织 基因表达

缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是一种随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的快速转录因子，因其可诱导血管内皮细胞因子、促红细胞生成素及诱导性一氧化氮合成酶等靶基因的转录，而成为低氧应答反应的调控中心。作为治疗缺血性疾病的一种候选基因，HIF-1α在缺血性疾病中具有极大的应用价值〔1〕，近年来已成为缺血性脑血管病的一个研究热点。但脑组织发生缺血再灌注后HIF-1α在基因水平的表达规律和特点，以及中药对其表达的调控作用，国内外鲜见报道。本研究利用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，观察局灶性缺血再灌注对HIF-1α表达的影响及中药对其表达的调控，探讨其在脑缺血再灌注发生后的表达。

　　1 材料与仪器

　　1.1 动物SD大鼠，雌雄不限，体重（300±20） g，由南京中医药大学实验动物中心提供。

　　1.2 试剂与仪器RevertAid TMFirst strand cDNA Synthesei Kit（Fermentans）；DR001AM Kit（TakaRa）；PTC-225 Peltier Thermal cycler PCR仪（MJ Research）；Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler荧光定量PCR仪（Corbett Reseach，Australia.）；Rotor-Gene 6.0分析软件。

　　2 方法

　　2.1 动物分组及造模大鼠随机分为缺血再灌注组、假手术组和用药组，每组10只。用药组于术前3 d开始，每天按8 mg/100 g体重腹腔注射盐酸川芎嗪，其余两组腹腔注射相应体积生理盐水。实验第4天采用Longa〔2〕颈外动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。假手术组仅分离血管和神经，不插入线栓。用药组于缺血10 min后按8 mg/100 g体重腹腔注射盐酸川芎嗪，缺血再灌注组和假手术组于同样时间腹腔注射相应体积的生理盐水。

　　2.2 标本制取于预定时间，以10%水和氯醛再次麻醉动物，37℃生理盐水250 ml经左心室灌注冲洗，直至右心耳流出清亮液体。大鼠断头后快速于冰盘上取出全脑，用锡箔包裹后置于液氮中保存。

　　2.3 Real-Time PCR方法检测

　　2.3.1 总RNA提取称取组织0.1 g放入装有1 ml Trizol的10 ml离心管中，在冰浴条件下匀浆至组织完全呈粉末状。加入200 ml氯仿，用力颠倒混匀，室温静置10 min，于4℃，13 000 r/min离心30 min，从每管中吸取上清液至另一1.5 ml离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃沉淀1 h。再次于4℃，13 000 r/min离心20 min，弃去上清液。加入500 μl 75％乙醇，洗涤沉淀。于4℃，13 000 r/min离心10 min，弃上清液。加入10 μl DEPC-Water至完全溶解，进行电泳并进行紫外分析测定。

　　2.3.2 RNA样品反转录利用RNA反转录试剂盒进行RNA反转录，反转录体系：TaKaRa Taq（5 U・μl-1），0.13 μl；10×Buffer，2.5 μl；MgCl2，1.5 μl；Dnip Mixture，2 μl；Primer 1（20 μm），0.5 μl；Primer 2（20 μm），0.5 μl；DdH2O，加至25 μl。反应按照以下过程进行：① 95℃，2 min；② 95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；③步骤②为40个循环。