人源胸腺素α原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达(一)

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【摘要】 目的 克隆人胸腺素α原/白介素2 融合基因，构建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达。方法 采用RT?PCR方法，从人白血病细胞和人T淋巴细胞中分别扩增得到胸腺素α原/白介素2 基因，利用基因重组技术将融合基因片段重组于pET42a原核表达载体上，构建成pET42a?PI。经酶切、测序鉴定后，将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta，IPTG诱导蛋白表达。表达产物经离子交换和分子筛纯化后进行Western blot分析，通过人外周血单核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行了初步的活性测定。结果 凝胶电泳显示PCR产物的长度约750 bp，测序结果表明，扩增片段与预期序列一致。重组菌在IPTG诱导下表达相对分子质量为28 kDa的蛋白，纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率，表明具有一定活性。结论 成功克隆和构建了人胸腺素α原/白介素2融合基因的原核表达载体，并在原核表达系统中得到有效表达。

【关键词】 胸腺素α原；白介素2；融合蛋白；表达

　　Abstract:Objective To clone human prothymosin α and interleukin?2 fusion gene into the prokaryotic expression vector and to express the fusion protein effectively in E.coli system.Methods The human prothymosin α and interleukin?2 gene were amplified by RT?PCR from human leukemia cells and T lymphocytes respectively. The two genes were fused with a linker and the fusion gene fragment was used to construct a prokaryotic expression vector pET42a?PI by DNA rebinant technique. After identification by restriction analysis and DNA sequencing, the rebinant plasmid was transformed into E.coli Rosetta. The overexpressed protein induced by IPTG was purified by anion exchange chromatography and Sephacryl S?200 chromatography. The biological activity of the fusion protein was assayed using T cell E?rosette formation test of human blood. Results The PCR product was about 750 bp in length, which was consistent with the expected size of the fusion gene. Plasmid pET42a?PI was transformed into Rosetta and a new protein with a relative molecular weight of 28 kDa was expressed. The purified fusion protein could increase the E?rosette formation rate of human peripheral mononuclear cells.Conclusion The encoding sequence of human prothymosin α and interleukin?2 fusion gene was suessfully cloned into the prokaryotical expression vector pET42a and can be expressed effectively in E.coli system.

　　Key words:prothymosin α; interleukin 2; fusion protein; expression

　　人源胸腺素α原(prothymosinα，proTα)是由109个氨基酸组成的一种小分子酸性蛋白。它具有多种不同的生物学活性，主要是促进细胞增殖和具有免疫调节剂的作用〔1-3〕。胸腺素α原作为细胞外信号蛋白，对细胞凋亡起调节作用，在细胞凋亡抑制剂的协同下可预防脑部中风〔4〕。Skopeliti等〔5〕在外周血单核细胞的培养过程中加入proTα，培养液中检测到IL?1及其受体、hsp90等多种蛋白的过度表达，而产生的IL?1可激活T细胞受体而促进T细胞增殖和IL?2的产生。人白细胞介素2 (Interleukin2, IL?2) 是由133个氨基酸组成的多肽。Burchill〔6〕等人研究发现IL?2和IL?2R(IL?2受体)主要是调整T细胞生长和维持T细胞的稳定。IL?2可缩短脑脊髓炎自身免疫过程并增强荷瘤鼠的免疫调节作用，对因移植性或化学方法诱发的肿瘤产生治疗效果〔7〕。IL?2还能提高NK细胞（自然杀伤细胞）和LAK细胞（淋巴因子激活的杀伤细胞）的活性，可以用于治疗癌症，但是过度使用IL?2会带来不良反应。IL?2和 proTα协同作用于自体肿瘤的反应比单独使用IL?2所引起的反应要强〔8,9〕。IL?2和proTα的联合使用不仅能降低单独使用IL?2产生的毒副作用，而且还能够提高抗肿瘤的效果〔8,10〕。因此，本研究将IL?2和proTα进行融合，并引入柔性连接肽Linker，构建了proTα/IL?2融合蛋白的原核表达载体pET42a?PI，并在大肠杆菌系统中得到了有效表达，为进一步研究该融合蛋白的功能奠定基础。

1 材料与方法

　　1.1 材料

菌种Rosetta(DE3)、载体pET42a由本实验室保存。RNA提取试剂盒：Qiagen公司，RT?PCR试剂盒、限制性内切酶Nde I和Xho I、T4DNA连接酶、DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit购自大连宝生物公司，HRP兔抗羊酶标二抗购自Sigma公司，人HL?60白血病细胞购自中山大学，HitrapTM Q阴离子交换柱、Sephacryl S?200购自安玛西亚公司，其他试剂均是进口或国产的分析纯试剂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计

　　将白介素2融合于胸腺素α原的羧基端，为保持两者的活性，在两者之间放入一段连接肽，连接肽的组成：S?G?G?G?G?S。proTα基因的克隆：上游引物：P1：5＇?AGGATCATATGTCA GACGCAGGTAG?3＇；下游引物：P2：5＇?ACTAAG CTTTTAGTCATTCGTCGGTCTTC?3＇。IL?2基因的克隆：上游引物：P3：5＇?GTCGGATATGGCAT ACTTCAAGTTCTACAAAGAA?3＇；下游引物：P4：5＇?AGGCTCGAGTTAAGTTAGTGTTGAGATGATGC TTTG?3＇。proTα/IL?2融合基因的克隆：上游引物：P5：5＇?TTCTTTGTAGAACTTGAAGTAGGTGCAGAG AGACGAGTCATTCGTCGGTCTTCT?3＇，下游引物：P6：5＇?AGAAGAGACGAGGATGAC TCGGGTGGCGGTGGCTCTGCATACTTCAAGTT CTACAAAGAA?3＇。其中，引物P1和P4分别引入了限制性酶切位点Nde I和Xho I。

　　1.2.2 目的基因的PCR扩增

　　用引物P1和P2从人HL?60白血病细胞中进行RT?PCR克隆出proTα基因；用引物P3和P4从人T淋巴细胞中进行RT?PCR克隆出IL?2基因；以IL?2 DNA片段为模板，用引物P3和P5进行PCR，获得linker?IL?2；以proTαDNA片段为模板，用引物P4和P6进行PCR，获得linker?proTα；用linker?IL?2和linker?proTαDNA片段以 1∶1混合作为模板，用引物 P1 和P6进行PCR，扩增出融合基因proTα?linker?IL?2 DNA片段（PI）。每步PCR都包含相应的模板和上下游引物、Tag聚合酶、dNTPs ，PCR仪设定的扩增条件：先在94 ℃变性5 min ，再于94 ℃1 min，58 ℃1 min ，72 ℃1 min 进行30个循环，最后于72 ℃延伸10 min，PCR结束后，取1 μL反应液进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。PCR 产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后，DNA回收试剂盒回收纯化。

　　1.2.3 重组质粒pET42a?PI的构建及鉴定

　　用限制性内切酶Nde I、Xho I对经试剂盒纯化后的PCR产物和表达载体pET42a进行双酶切，酶切完毕，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，切下胶中所需片段，以DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit回收。酶切后的PCR产物与回收后的载体用T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌Rosseta，将重组菌Rosseta/pET42a?PI涂布于含有35 μg/mL氯霉素和100 μg/mL 卡那霉素的LB琼脂平板，挑取阳性单克隆，置含相应抗生素的LB培养液的试管中37 ℃振摇过夜，用碱裂解法小量制备质粒DNA，获取的质粒分别用Nde I和Xho I单、双酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，质粒进行DNA测序鉴定。

　　1.2.4 融合蛋白的诱导表达

将鉴定正确的阳性克隆菌株Rosseta/pET42a?PI，接种到含有35 μg/mL氯霉素和100 μg/mL 卡那霉素的5 mL LB 培养基中，在37 ℃ 以180 r/min 培养过夜，以1∶50 比例接种至含相应抗生素的50 mL LB 中，在37 ℃，180 r/min 条件下培养至A600 为0.4～0.5，用终浓度为1 mmol/L 的IPTG 诱导蛋白表达。之后在同等条件下继续培养4 h。取适量菌液在4 ℃条件下，5 000 r/min 条件下离心5 min，菌体沉淀用1 mL 细菌裂解液（50 mmol/L Tris?HCl，pH=7.2，50 mmol/L NaCl）重悬。重悬液用超声法破碎细胞，裂解菌体再在13 000 r/min 条件下离心5 min。分别取菌体裂解上清液（可溶蛋白部分）和沉淀重悬液（不可溶蛋白部分）各10 μL，SDS?PAGE电泳分析蛋白表达情况。

　　1.2.5 融合蛋白的纯化

　　菌体经超声破碎后，4 ℃，13 000 r/ min，离心10 min，取上清，用0.22 μm低蛋白吸附的滤器过滤后上样。经阴离子交换柱粗纯（平衡缓冲液50 mmol/L Tris?HCl，pH7.5，10 mmol/L NaCl；洗脱缓冲液50 mmol/L Tris?HCl，pH7.5，500 mmol/L NaCl），洗脱峰再过Sephacryl S?200分子筛(20 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，pH7.5)，收集洗脱峰并进行SDS?PAGE电泳分析。