正交设计优化茴香随机扩增多态DNA反应体系的研究(一)

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作者：李海渤，王羽梅，何金明

【摘要】 目的建立茴香的随机扩增多态DNA（RAPD）最佳反应体系。方法正交设计及方差分析应用于建立RAPD反应体系的研究。结果茴香的RAPD最佳反应体系为25 μl的反应体系中，含10×Buffer 2.5 μl，2.0 m MdNTPs 3.0 μl，2.0 U/μl Taq酶1.0 μl，2.0 μmol/L随机引物4.0 μl，30.0 ng/μl模板DNA30 ng，ddH2O 13.5 μl。结论正交设计及方差分析适用于茴香RAPD反应体系的建立。

【关键词】 茴香； 正交设计； 随机扩增多态DNA； 反应体系； 方差分析

　　Abstract：ObjectiveTo establish optimal RAPD reaction system of Fennel.MethodsThe orthogonal design and variance analysis were used to optimize the RAPD system.ResultsThe optimal Fennel RAPD system was posed of 2.5 μl 10×PCR Buffer,3.0 μl dNTPs(2.0 mmol/L),1.0 μl TaqE(2.0 U/μl ),4.0μl Primer(2.0 μmol/L),1.0 μl DNA(30.0 ng/μl ),13.5 μl ddH2O with total 25 μl reaction system.ConclusionThe orthogonal design and variance analysis can be used to optimize the RAPD system.

　　Key words：Fennel; Orthogonal design; RAPD; Reaction system; Variance analysis

　　茴香Foeniculum vulgare Mil1.为伞形科茴香属多年生宿根草本植物，原产地中海沿岸及西亚，在我国北方各地被广泛栽培。

　　茴香的茎、叶、种子都含有挥发油，其主要成分为茴香醚及茴香酮，具有特殊的香味。我国北方主要把茴香作调味品或馅食。其果实可作香料及药用，有温肝肾、暖胃气、散寒结的作用〔1〕。

　　随机扩增多态DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)标记是由Williams 等和Welsh等在PCR技术基础上发展起来的一种分子标记，广泛应用于遗传多样性分析、物种进化、品种鉴定、分类等研究领域。为了更好地利用RAPD技术对茴香进行聚类分析，确定品种间亲缘关系，进而为茴香育种提供理论指导，本研究以内蒙古茴香DNA为材料，采用正交设计构建扩增方案，并对实验结果进行方差分析，对各因素水平间进行了SSR法多重比较，最终建立了适合于茴香的RAPD最佳反应体系，以期为进一步的RAPD研究打下坚实的基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 DNA的提取以SDS法提取内蒙古茴香总DNA，以1.0 ％(W／V)琼脂糖凝胶电泳检测所得DNA质量，并用UV3000型紫外分光光度计检测DNA浓度，ddH2O稀释至30.0 ng/μl。

　　1.2 正交设计方法选用L25（56）正交表（见表1）。共设计25个处理，反应总体积为25 μl，每个反应体系均含10×PCR Buffer（含20 mmol/L Mg2+）2.5 μl，其余组分〔Taq DNA聚合酶、dNTPs（北京鼎国生物技术有限责任公司提供）；引物（北京奥科生物技术有限责任公司提供）；DNA〕按表1稀释并添加，再用ddH2O将体系补至25.0 μl。

　　表1 RAPD反应体系的正交设计及扩增结果（略）

　　1.3 PCR扩增与产物检测在FTH-04AB-102型PCR仪（杭州大和热磁电子有限公司）上进行扩增，热循环参数为95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，45℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

　　扩增产物在1.0 ％(W／V)琼脂糖凝胶中电泳，以λDNA（EcroI+HindⅢ）（北京鼎国生物技术有限责任公司提供）为Marker，经EB染色。在hnageMaster VDS凝胶成像系统上成像检测，照相并存盘。

　　1.4 数据分析统计每个处理扩增后DNA片段数目，并参照Marker电泳片段的亮度对处理所得片段亮度进行打分，打分标准为：片段亮度大于等于21 228 bp片段，分值为5分；片段亮度介于5 146～3 530 bp片段之间，分值为4分；片段亮度介于2 027～1 904 bp片段之间，分值为3分；片段亮度介于1 584～1 375 bp片段之间，分值为2分；片段亮度低于1 375 bp片段，分值为1分。平均片段亮度＝某处理片段亮度得分总和/某处理片段总数。

　　对所得片段数目及亮度两个结果分别进行方差分析及SSR法各因素水平间多重比较，获得较好的反应体系。

　　1.5 最佳反应体系的验证为验证最佳反应体系的稳定性，采用多个引物对多个茴香材料进行RAPD扩增，观察其重复性及稳定性。

　　2 结果

　　2.1 正交设计的处理结果及分析选用引物P41（GTTTCGCT）按表1设计对内蒙古茴香进行RAPD扩增（见图1，表1）。分别对表1扩增片段数量及扩增片段亮度进行方差分析。结果见表～3。