灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL?1α, IL?2 mRNA表达的拮抗作用(一)

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作者：张群 雷林生 余传林 吴曙光

【摘要】 【目的】观察灵芝多糖（GLB）对前列腺素E2（PGE2）抑制小鼠脾细胞增殖及IL?1α、IL?2 mRNA表达的拮抗作用。【方法】采用混合淋巴细胞培养反应作为实验模型，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖程度，半定量逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）法检测IL?1α及IL?2 mRNA的表达水平。【 结果】PGE2连续作用48h后，脾细胞增殖反应受到不同程度的抑制作用，当PGE2浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P＜0.01);固定PGE2的浓度为20 μmol/L，并合用不同浓度的GLB（25、50、100、200mg/L），当GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2（20 μmol/L）的抑制作用(P＜0.05);培养8h及12h后，PGE2（20 μmol/L）可抑制IL?1α及IL?2 mRNA的表达，GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。【结论】灵芝多糖可部分拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞增殖及IL?1α和IL?2 mRNA表达的抑制作用。

【关键词】 灵芝多糖/药理学； 肿瘤/中药疗法； 肿瘤/免疫学； 细胞培养

灵芝〔Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr. Karst.)〕是灵芝菌科灵芝属真菌。文献报道〔1-3〕，灵芝多糖（GLB）是灵芝中主要的生物活性成分之一，其主要的药理作用为增强免疫功能和抗肿瘤。目前其抗肿瘤作用的机制尚不清楚。肿瘤逃避免疫监视的机制比较复杂，其中之一是有些肿瘤细胞能直接分泌〔4-5〕或刺激巨噬细胞〔6〕分泌前列腺素E2(PGE2)，后者可对免疫系统产生广泛的抑制作用。藉此，肿瘤得以逃避免疫系统的攻击，在体内无限生长。本研究观察了灵芝多糖对PGE2抑制小鼠脾细胞增殖及IL?1α和IL?2 mRNA表达的影响，探讨灵芝多糖的抗肿瘤免疫学机理。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 C57BL/6j及BALB/c小鼠（SPF级），8～10周龄，雌雄兼用，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号分别为：2005A044和2005A046。

1.2 药品与试剂 RPMI?1640培养基（GIBCO公司产品）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；HEPES（MDBio, Inc分装）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、焦碳酸二乙酯（DEPC）、前列腺素E2（PGE2）均为Sigma产品；RNAoutTM（深圳市华氏生物技术有限公司产品）；傻瓜逆转录（RT）反应体系〔AuPower RT PreMix， 内含逆转录酶、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、RNA酶抑制剂、缓冲剂等〕, 傻瓜聚合酶链反应（PCR）体系（PCR PreMix，内含Tag DNA聚合酶、dNTPs、PCR增强剂、缓冲剂、上样染料及稳定剂）均购自赛百盛公司；Oligo d T 18(TaKaRa产品)；琼脂糖（Biowest Agarose, 上海YITO生物器材企业有限公司分销）；溴化乙锭(EB, 上海博彩生物工程公司产品)；GLB参照文献方法〔7〕提取，为多糖组分，呈浅棕色，易溶于水，分子量7 000～9 000D。其他化学试剂均为分析纯。

1.3 仪器 311型CO2培养箱（美国Forma Scientific 公司）；AB?120型电子分析天平（美国Denver Instrument公司）；连续波长酶标仪（Bio?RAD公司）；CS?15R台式低温高速离心机（Bechman公司）；PTC?100TMPCR循环仪（美国MJ Research. Inc.公司）；Power PAL3000电泳仪（Bio?RAD公司）；凝胶成像分析系统(法国Ets VILBER LOURMAT公司）。

1.4 方法

1.4.1 混合淋巴细胞培养 参照文献〔8〕进行。

1.4.2 MTT法检测细胞增殖程度 参照文献〔8〕进行。结果用570nm处的光密度(D570)值表示。

1.4.3 总RNA提取 根据试剂盒说明书所提供的方案按比例缩小进行操作。于96孔板中，每孔加RNAoutTM试剂40μＬ，每组收集10孔裂解液于0.5mＬEppendorf管中，提取总RNA。

1.4.4 逆转录反应 DEPC处理水配制的Oligo dT18 (10 nmol/L)与DEPC处理水配制的总ＲＮＡ （0.1 mg/L）按体积比1∶1混合于Eppendorf管中，70℃孵育5min，４℃冷却２min。吸取上述混合液20μL加入AuPower RT PreMix 管中，振荡混匀，加石蜡油15μL，1000r/min离心3s，置PCR循环仪中反应。反应参数如下：42℃、60min，94℃、5min。

1.4.5 PCR扩增 PCR引物采用在线软件Primer 3进行设计。小鼠IL?1α：上游引物 5’?GCATTCACAGCAGGATTT?3’，下游引物 5’?GAATAGGGGAAACACTGA?3’，PCR扩增产物为354bp。小鼠IL?2：上游引物5’?AAGCTCTACAGCGGAAGCAC?3’，下游引物5’?TCATCGAATTGGCACTCAAA?3’，PCR扩增产物为348bp。小鼠β?actin：上游引物 5’?AGAGCAAGAGAGGTAT?3’，下游引物 5’?GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA?3’，PCR扩增产物为216bp。经预实验发现IL?1α和IL?2 mRNA的表达丰度约为β?actin的1/5左右，为了使被检测基因的扩增速率与β?actin的扩增速率基本一致，均处于指数扩增范围从而防止平台效应，在进行β?actin基因扩增时，将逆转录第1链cDNA 产物稀释5倍，其他条件与被检测基因相同，操作如下：在PCR PreMix 管中加入消毒双蒸水8μL, 被检测基因mRNA逆转录产物2 μL或内参β?actin mRNA逆转录产物经5倍稀释后2 μL，相应的上、下游引物各5μL(15pmol)，振荡混匀，加石蜡油15μL，1000r/min 离心3s，置PCR循环仪中反应。反应参数如下： 94℃预变性2.5min, 然后进入以下28个循环：94℃变性45s，57℃退火1min，72℃延伸1.5min。循环完毕，72℃延伸5min。

1.4.6 半定量分析 取被检测基因和β?actin RT?PCR扩增产物上样于20g/L琼脂糖凝胶（含溴化乙锭0.5g/L）梳孔中，采用0.5倍Tris?硼酸电泳缓冲液，在3V/cm电压条件下电泳50min。将凝胶转移至凝胶分析系统暗箱中，在紫外线照射下测定PCR扩增产物的荧光强度(I)值。结果表示为：p=〔I检测基因/（Iβ?actin×5）〕×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。混合淋巴细胞培养反应数据的显著性差异采用独立样本t?检验；PCR半定量数据采用配对样本t?检验。

2 结果

2.1 PGE2对混合淋巴细胞培养反应（MLR）抑制作用的造模浓度 将C57BL/6j及BALB/c小鼠脾细胞按体积比1∶1混合作为MLR模型，PGE2连续作用48h后，小鼠脾细胞增殖受到不同程度的抑制作用，浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P＜0.01)。根据表1结果，选择PGE2抑制模型的造模浓度为20 μmol/L。