人B 淋巴细胞刺激因子体外活性分析(一)

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【摘要】 目的: 分别采用MTT和ATPLiteTM?M发光法分析人B细胞刺激因子对培养的小鼠脾细胞的生物学活性。方法: 分离小鼠脾细胞, 培养72 h后, MTT和ATP方法测定不同密度脾细胞的增殖, 从中选定适当的脾细胞密度分析BLyS活性。然后, 检测不同剂量的BLyS对脾细胞的刺激作用。结果: 用MTT和ATPLiteTM?M发光法分析发现: BLyS在1、 5、 10和20 mg/L时, 都能明显促进小鼠脾细胞的增殖。结论: MTT法检测BLyS对小鼠脾细胞的增殖作用是一种简单、 快捷的方法。利用这种细胞模型, 可以对BLyS拮抗剂进行初步筛选以期获得具有潜在应用价值的治疗剂。

【关键词】 B细胞刺激因子 自身免疫性疾病 ATPLiteTM B细胞 MTT

　　B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS)是TNF 家族中的一员[1], 又称为B细胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF)[2], 由单核细胞和巨噬细胞持续合成、 分泌。BLyS以膜结合和可溶性两种形式存在。膜结合型BLyS由285个氨基酸组成, 经蛋白酶水解膜外区的133～134氨基酸残基肽链后, 可产生由152个氨基酸组成的可溶性活性多肽?可溶性BLyS(soluble BLyS, sBLyS), 进入血液循环。在体内、 外, sBLyS均具有特异地刺激B细胞的作用, 是B细胞发育、 存活所必需的[3]。而过量表达BLyS与某些自身免疫性疾病, 如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)、 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)和口眼干燥综合征(Sjogren syndrome, SS)等有关[4]。在这些疾病患者血清中, BLyS水平也明显升高[5, 6]。目前, BLyS拮抗剂治疗SLE和RA正处在临床试验阶段, 有望成为治疗SLE和RA的新方法。

　　本研究中采用MTT和ATPLiteTM?M发光法, 探讨了人BLyS对小鼠脾细胞的作用。这将为进一步寻找潜在BLyS的拮抗剂提供了初步筛选的简捷方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 BALB/c小鼠由军事医学科学院动物中心提供。可溶性BLyS(sBLyS)的原核表达载体及其空白质粒pET?30a, E.coli BL21菌株由本室保存。镍螯合琼脂糖凝胶购自北京本元正阳基因技术股份有限公司。sBLyS的表达、 纯化参照文献[7]报道。ATPLiteTM?M发光法试剂盒购自PerkinElmer life sciences公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠脾细胞的制备 取4～6周龄的小鼠, 脱臼处死后, 泡于750 mL/L乙醇中消毒。取出小鼠, 放置平板上呈俯卧位。用镊子夹起左侧皮毛部, 剪开皮肤、 腹膜, 分离脾脏, 放置平皿中。轻柔剪去脾脏两侧系膜及周围组织, 于平皿中加入1～2 mL生理盐水, 轻摇平皿洗涤。用平扁齿镊子轻挤压脾脏包膜, 将脾脏细胞挤至平皿中, 形成细胞悬液。预先于10 mL试管中加入3 mL小鼠淋巴细胞分离液, 再沿管壁缓缓加入6 mL细胞悬液,形成不同的液面层。2000 r/min室温离心30 min。轻轻环绕吸取界面细胞, 加入生理盐水6～8 mL, 混匀、 洗涤。1500 r/min离心5 min。弃上清, 所得沉淀即为脾细胞。

　　1.2.2 不同密度脾细胞增殖的分析 调整脾细胞密度为1×109、 2.5×109、 5×109、 1×1010和2× 1010细胞/L, 96孔板每孔分别加入100 μL, 于37℃、 50 mL/L CO2条件下培养72 h。MTT法分析时, 在培养终止前6 h, 加入5 g/L MTT 10 μL, 继续培养至72 h, 每孔加入100 μL 100 g/L酸化SDS裂解细胞, 于酶标仪ELISA?reader读取A570值。ATPLiteTM?M发光法参照生产商说明书操作。每孔加入50 μL细胞裂解液, 轻轻振摇5 min; 再每孔加入50 μL底物溶液, 轻轻振摇5 min。光信号以每分钟计数(counts per second, CPS)为单位, 于Wallace 1420 multilabel counter VICTOR3(PerkinElmer, Singapore)仪测量。

　　1.2.3 BLyS对脾细胞作用的分析 每孔加入固定密度的脾细胞。再分别加入不同浓度的BLyS。以pET?30a空载体表达的74个氨基酸组成肽作为对照。于37℃、 50 mL/L CO2条件下培养72 h。同1.2.2, MTT和ATPLiteTM?M发光法测细胞增殖。刺激指数(Stimulating index, SI)分别按以下公式计算: MTT法SI=(实验组A570－细胞本底A570)/细胞本底A570; ATPLiteTM?M发光法SI=(实验组CPS－细胞本底CPS)/细胞本底CPS。

　　2 结果

　　2.1 脾细胞增殖曲线 测定了不同密度小鼠脾细胞的增殖, 以确定分析BLyS活性的适当细胞密度（图1、 2）。选取5×109细胞/L用作MTT法检测BLyS活性的脾细胞密度; 3×109细胞/L用作ATPLiteTM?M发光法检测BLyS活性的脾细胞密度。