脂康调节高脂血症家兔肝脏LDL-R mRNA水平的实验研究(一)

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【摘要】 目的 通过建立新西兰家兔高脂血症模型,探讨肝脏低密度脂蛋白受体基因水平与高脂血症形成的关系。方法 （1）建立高脂血症家兔模型；（2）应用原位杂交方法检测肝脏低密度脂蛋白受体基因水平。结果 （1）成功建立高脂血症家兔模型；（2）脂康方剂可有效降低血脂水平，并能有效上调肝脏低密度脂蛋白受体基因水平。结论 脂康方剂可激活肝脏细胞膜LDL-R基因表达，使LDL-R的活性增强，从而加速脂蛋白的分解，有效调节血脂水平。

　　【关键词】 高脂血症； 低密度脂蛋白受体； 基因表达

　　Study the effect of Zhikang on blood-lipid and low density lipoprotein receptor mRNA in rabbit

　
　　【Abstract】 Objective To study the immune mechanism of Zhikang to control the development of hyperlipidemia.Methods (1)To set up hyperlipidemia models of New Zealand rabbits.(2)To observe the pathological changes in liver.(3)To study the effects of Zhikang by detecting the levels the gene of low density lipoprotein receptor through ISHH(in situ hybridization histochemistry). Results (1)A hyperlipidemia model was suessfully established by using high-fat diet in New Zealand rabbits.(2)Zhikang can effectively reduce the level of lipids and it can increase the levels of the gene of low density lipoprotein receptor. Conclusion Zhikang can effectively reduce the level of lipids and improve the condition of atherosclerosis ,at the same time,it can effectively regulate the immune functions on the levels of gene of low density lipoprotein receptor.

　　【Key words】 hyperlipidemia;low density lipoprotein receptor;gene expression

　　高血脂能导致冠状血管等全身血管的不同程度硬化，导致各种临床并发症。目前治疗血脂异常、动脉硬化的西药虽然在临床取得了一定的疗效，但同时其对肝、肾功能会产生一定的影响，不利于长期服用。研制毒副作用小，疗效显著、具有多靶点综合治疗效应的中药复方制剂，是目前中医临床研究的一个热点。中药脂康由黄芪、沙棘、山楂、红花、丹参、三七粉等组成，具有健脾益气、祛痰降浊、调整阴阳气血和脏腑功能、活血化瘀之功效，适用于高脂血症及轻中型冠心病，在临床上应用数年，对高脂血症及动脉硬化的防治上已取得了很好的疗效。脂康通过清除人体内的痰浊、瘀血等有害物质，抑制脂质合成，促进脂质的转运和清除，加速脂质排泄等多种途径调节血脂。本实验主要从基因水平上研究脂康对高脂血症家兔肝脏低密度脂蛋白受体基因表达的调节作用，从而探讨脂康调节血脂的主要机理。

　　1 材料与方法

　　1.1 脂康方药的制备 本处方由沙棘、山楂、丹参、红花、黄芪、三七等为主组成。经醇提、水提、干燥后制成丸剂，每丸0.5g。等临床剂量按人和动物体表面积换算，相当于60kg体重人每日的药量。

　　1.2 实验动物造模及用药方法 纯种新西兰大耳白兔60 只，体重1.9～2.1kg,兔龄4个月，随机选取10只为正常组，喂饲普通颗粒饲料，150g／d，其余50只给予高脂饲料（1％胆固醇、5％蛋黄粉、5％猪油、89％普通饲料）喂饲，150g／d 。于第4周末根据胆固醇情况随机分为5组，每组 10只：模型对照组给予高脂饲料喂饲，150g/d；其余用药组除给予高脂饲料喂饲150g/d外，脂康低剂量组给予脂康浸膏0.2 g /（kg・d）；脂康高剂量组给予脂康浸膏0.4 g /（kg・d）；血脂康对照组给予血脂康0.1g/（kg・d）；辛伐他汀对照组给予辛伐他汀0.8mg/ （kg・d）。

　　喂饲8周后，麻醉，心脏取血，用于血脂项目检测。取靠近肝门静脉处的肝脏组织，直径约2cm，用浓度10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，用光镜观察。另取肝脏组织，直径约1cm，用浓度4%的多聚甲醛固定后做LDL-R mRNA（原位杂交）检测。

　　1.3 生化指标检测 分别于用药前取耳缘静脉血及用药后心脏取血10ml，离心3000r/min，10min，取血清分装，－20℃冰箱保存，血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量测定采用酶法，根据Friedward公式法计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，即LDL-C=TC-（TG/2.2+HDL-C)。动脉硬化指数（AIP）为TG与HDL-C摩尔浓度比值的对数。血脂检测试剂盒（北京中生生物工程高技术公司生产）。

　　1.4 肝脏组织LDL-R mRNA原位杂交检测 （LDLR ISH 原位杂交试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司提供）。

　　1.4．1 实验步骤 (1)将新鲜的肝组织切成不超过4mm的小块，并及时用固定液固定1h。(2)常规脱水、浸蜡、包埋，切片厚度为6～8μm。(3)石蜡切片经常规二甲苯、乙醇脱蜡，滴加H202，室温5～10min以灭活内源性酶。(4)暴露mRNA核酸片段:切片上加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶。37℃ 12～15min，清洗。(5)后固定:胃蛋白酶消化后在玻片上滴加固定液室温固定10min，清洗3次。(6)预杂交:首先将湿盒准备好，每张切片滴加20μl预杂交液，放入湿盒内， 38℃～42℃ 4h，甩去多余的液体。(7)杂交:在每张玻片上滴加20μl杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。放恒温箱杂交过夜。(8)杂交后洗涤。 (9)滴加封闭液:放入37℃ 30min后取出，甩去多余液体，不洗。(10)滴加生物素化鼠抗地高辛:放入37℃ 60min，PBS洗涤。(11)滴加SABC:放入37℃ 30min， PBS洗涤。(12)滴加生物素化过氧化物酶:37℃恒温箱中放置30min，PBS洗涤。(13)DAB显色:使用DAB显色试剂盒，滴至玻片上，显色30～50min，充分水洗，苏木素复染，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，封片。

　　1.4．2 原位杂交实验结果判定 光学显微镜下观察结果的判定标准:原位杂交结果以细胞浆内或核膜上出现棕黄色颗粒者或斑片为阳性细胞。

　　1.4．3 分析方法和统计学处理 计算机图像分析，在图像卡IBM586和Olympus BX60显微镜组成的图像处理系统上，测定阳性细胞数:每组每只大鼠各5个高倍视野(10×40)下原位杂交阳性细胞率(%)。

　　1.5 结果统计 计量资料采用单因素方差分析，F检验，结果用均数和标准差(x±s)表示。用SPSS10.0统计软件对结果进行统计。