131I- Rituximab对B细胞淋巴瘤生物学效应的实验研究(一)

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作者：蔡秋琼，杜明华，陈宝安，钟英，黄科，屈海船

【摘要】 目的:研究131I标记的Rituximab对B细胞淋巴瘤细胞的生物学效应以及对荷人Raji细胞移植瘤裸鼠的放射免疫治疗效果，为放射免疫导向治疗提供实验依据。方法：体外培养人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞，裸鼠皮下接种Raji细胞成瘤，IODO- GEN法将131I标记于Rituximab，将细胞分为131I- Rituximab组、单纯抗体组、单纯核素组及空白对照组4组，流式细胞仪检测各组Raji细胞凋亡和细胞周期；取30只成瘤裸鼠随机分成高、中、低剂量治疗组及单纯抗体组、单纯核素组、空白对照组6组，进行裸鼠的放射免疫治疗研究。每周测量裸鼠荷瘤大小1次,4周后处死裸鼠,取瘤称重，常规病理分析。结果：131I- Rituximab组凋亡率高于其他各组；131I- Rituximab组细胞周期发生变化，大部分被阻滞在G2期。裸鼠各治疗组与对照组比较，肿瘤生长减慢,肿瘤生长抑制率具有剂量时间依赖性,组织病理学检测显示治疗有效。结论：131I- Rituximab能够诱导Raji细胞凋亡并调控细胞周期，而且可特异性地定位于肿瘤组织,发挥放射免疫导向治疗作用,具有潜在的临床应用价值。

【关键词】 放射免疫治疗； B细胞淋巴瘤； 抗CD20单克隆抗体； 131I-Rituximab

非霍奇金淋巴瘤（NHL）是最常见的淋巴系统恶性肿瘤之一，其绝大多数是B细胞来源，放射免疫治疗（RIT）属于内照射治疗，已成为目前B细胞NHL治疗的研究热点。本实验将Rituximab-人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体偶联放射性核素131I，从体外和体内实验两方面研究其对B细胞淋巴瘤的生物学效应。

1 材料与方法

1.1 细胞与实验动物

人B淋巴瘤细胞系Raji细胞购于中国科学院上海细胞研究所；BALB/c裸鼠（4～6周龄）购于中国科学院上海实验动物中心，于东南大学医学院SPF动物房饲养。

1.2 主要试剂及器材

Rituximab购于罗氏制药公司，Na131I购于南京森科公司，Iodogen(四氯二苯基甘脲)由苏州大学医学院核医学实验室提供，流式细胞仪为FACS Vantage SE型，SPECT显像仪为德国西门子公司E.CAM9358型。

1.3 细胞培养

用含10%胎牛血清、100 U・ml-1青霉素、100 U・ml-1链霉素的RPMI 1640培养液，在37 ℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中培养，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用流式细胞仪测定CD20表达率。

1.4 131I- Rituximab的制备

应用IODO- GEN法〔1〕标记，标记产物经Sephadex G- 25分离纯化，检测标记产物的标记率及放射化学纯度。

1.5 体外实验

1.5.1 分组 细胞换液后24 h，将细胞浓度调整为1×106 ml-1,分为4组。A组（131I- Rituximab组）：将131I- Rituximab加入Raji 细胞中，使131I- Rituximab的最终比放射性活度为3 μCi・ml-1（1 Ci=37 GBq），Rituximab的最终浓度为50 μg・ml-1；B组（单纯核素组）：将Na131I加入Raji细胞中，使Na131I的最终比放射性活度为3 μCi・ml-1；C组（单纯抗体组）：将Rituximab加入Raji细胞中，使Rituximab的最终浓度为50 μg・ml-1；D组（空白对照组）：加入等量培养液。上述各组剂量参照文献〔2〕确定。

1.5.2 观察指标 加药24 h后显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期：以Annexin Ⅴ- FIFC/PI双染法测定药物对细胞的早期诱导凋亡作用，采用DNA倍体分析法检测细胞周期，重复测定3次。

1.6 体内实验

1.6.1 B细胞淋巴瘤动物模型的建立 将处于对数生长期的Raji细胞，用不含血清的RPMI 1640调整细胞密度为1×107 ml-1,每只裸鼠皮下接种0.2 ml,30 d后部分裸鼠成瘤，挑选肿瘤直径约为0.8 cm的30只成瘤裸鼠进行实验分组。

1.6.2 实验动物分组 成瘤裸鼠模型随机分为6组（每组5只）。a组（高剂量组）：尾静脉注射131I- Rituximab 400 μCi；b组（中剂量组）：尾静脉注射131I- Rituximab 150 μCi；c组（低剂量组）：尾静脉注射131I- Rituximab 50 μCi；d组（单纯抗体组）：尾静脉注射Rituximab 0.8 mg；e组（单纯核素组）：尾静脉注射Na131I 150 μCi；f组（空白对照组）：尾静脉注射生理盐水0.2 ml。上述各组剂量参照文献〔3〕确定。

1.6.3 治疗效果观察 （1）观察实验动物的一般状况包括精神状况、皮肤光泽、活动度、饮食、饮水情况，并称体重；（2）每隔3～4 d测量肿瘤的长径和短径，根据公式计算肿瘤体积和肿瘤生长抑制率（IR）：V=ab2/2（a为长径，b为短径），IR=(V0-Vn)/V0×100%(V0代表非治疗组的肿瘤体积，Vn为治疗组的肿瘤体积)；（3）SPECT显像：分别于注射后4、24、48、72、96、168 h显像；（4）组织病理学检测：治疗4周后处死裸鼠分离肿瘤,称重后用10%福尔马林固定,HE染色，作常规病理检查。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0软件处理，进行方差分析，两两比较采用LSD法。

2 结 果

2.1 Raji细胞形态改变及CD20表达率

倒置显微镜下可见细胞为圆形，生长旺盛，聚集成团，透明度高，折光性强。流式细胞仪测定CD20表达率为98.03％。

2.2 131I- Rituximab的标记率及放化纯度

131I- Rituximab采用纸层析法测其标记率为90％，其稳定性好，4 ℃贮存24 h，其放化纯度为91％。

2.3 体外实验结果

2.3.1 镜下细胞形态学改变 A、B、C组细胞生长受到抑制，数量减少，细胞收缩，胞核变小。

2.3.2 细胞凋亡情况 细胞凋亡率 A组为59.94％，B、C、D组依次为48.21％、40.40％、1.06％，各组间差异具有统计学意义(P0.05)。

2.3.3 细胞周期分析 （1）A组有17.13%的细胞截止于S期，B、C、D组依次有24.31%、25.73%、33.32%，除B组和C组之间差异没有统计学意义以外，余各组间差异有统计学意义(P0.05)。（2）A组有69.01%的细胞截止于G2期，B、C、D组依次有65.10%、51.83%、50.13%。除A组和B组之间以及C组和D组之间差异没有统计学意义外，余各组间差异具有统计学意义(P0.05)。

2.4 体内实验结果

2.4.1 实验动物的一般情况 b组裸鼠精神状况、活动度、皮肤状况、饮食饮水量及体重均未发现明显异常变化；a、c和d组裸鼠精神情况尚可，活动度较b组略差，饮食饮水量轻度减少；e组和f组在实验后期裸鼠精神萎靡，皮肤暗淡，体重减轻，饮食饮水量明显减少。a组分别在注射后第2、3天各有一裸鼠死亡，说明剂量过高，射线对裸鼠本身有一定伤害作用。