锰对PC12细胞生长增殖及对ERK信号转导通路的影响(一)

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作者：李妍，陈景元，蔡同建，郑刚，杜可军，骆文静

【关键词】 MnCl2；大鼠；嗜铬细胞瘤PC12细胞；p

【Abstract】 AIM: To study the toxicity of different doses of MnCl2 on rat pheochromocytoma PC12 cells in vitro and their effects on signal transduction of extracellular signalregulated kinase 1/2 (ERK1/2). METHODS: PC12 cell cultures were exposed to MnCl2 within the range of 100900 μmol/L. The inhibition of the cells during 7 d was determined by MTT assay and plate clone formation test, and ERK1/2 and pERK1/2 were determined by Western blot. RESULTS: MnCl2 at different concentrations (100, 300, 500, 700 and 900 μmol/L) could inhibit the growth and proliferation of PC12 cells in a dose and timedependent manner and the cell growth curves were changed aordingly (P0.05). Western blot showed that MnCl2 decreased pERK1/2 expression in a dosedependent manner(P0.05). CONCLUSION: MnCl2 can significantly inhibit the growth and proliferation of PC12 cells, possibly by downregulating pERK1/2 expression.

【Keywords】 MnCl2; rats; pheochromocytoma PC12 cell; pERK1/2

【摘要】 目的： 研究不同浓度的锰对PC12细胞生长增殖及细胞外信号调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2)信号转导通路的影响. 方法： 体外培养大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞，以100~900 μmol/L MnCl2染毒后进行四唑盐比色实验(MTT)筛选锰的细胞毒性剂量，平板克隆形成实验观察MnCl2对细胞的抑制作用. Western blot检测ERK1/2及磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2 (pERK1/2)表达情况. 结果： MTT、平板克隆形成实验结果显示100～900 μmol/L MnCl2对细胞的生长增殖有不同程度的抑制作用(P0.05). Western blot结果显示随着染锰浓度的增高，PC12细胞pERK1/2表达量与对照组相比有显著性差异(P0.05). 结论： 一定浓度的MnCl2对PC12细胞的生长增殖有明显的抑制作用，这一作用可能是通过下调胞内pERK1/2表达实现的.

【关键词】 MnCl2；大鼠；嗜铬细胞瘤PC12细胞；pERK1/2

0引言

慢性锰中毒主要作用于黑质神经元，引起类帕金森病样症状〔1〕. 这主要是由于黑质含色素的神经元具有蓄积金属元素的特性. 近来有研究发现适量的锰可以抑制神经细胞增殖，引起神经细胞凋亡〔2〕. 丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases, MAPKs)信号转导通路在胞浆信号转导中起重要作用〔3〕，其中，细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signalregulated kinase,ERK)在所有MAPKs家族成员中最早被认识，且最具特征性. 被认为是一种增殖、转化和分化MAPKs〔4〕.

本研究以多巴胺能PC12细胞为研究对象，观察染锰不同浓度及不同时间对细胞增殖的毒性作用和对胞内ERK1/2磷酸化水平的影响，探讨锰对神经系统损伤的可能机制，为阐明锰神经毒作用的分子机制,寻求科学的诊断和治疗方法提供新的线索.

1材料和方法

1.1材料高分化PC12细胞购自中国科学院上海生命科学研究院；胎牛血清，杭州四季青公司产品；DMEM培养基，美国Gibco公司产品；细胞培养箱，英国Forma Scientific公司产品；MTT，美国Sigma公司产品；ERK1/2抗体(兔单抗)及p ERK1/2抗体(鼠单抗)购于美国Cell Signaling公司.

1.2方法

1.2.1MTT法绘制细胞生长曲线PC12细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基，于含50 mL/L CO2的37℃孵箱中湿化培养，取对数生长期的细胞按5×103个/孔接种于96孔板(Costar)中，待细胞铺满50%后，对照组仍以原培养基继续培养，各给药组分别给予含100, 300, 500, 700和900 μmol/L MnCl2的培养基进行四唑盐比色实验，用酶联免疫检测仪以490 nm波长测定各孔的吸光值(A值)，记录结果. MnCl2对细胞增殖的毒性作用以抑制率(IR)表示，其计算公式如下： IR(%)＝(A对照组-A给药组)/A对照组×100 并以时间为横轴，A值为纵轴，使用Microsoft Excel软件绘制细胞生长曲线.

1.2.2平板克隆形成实验检测细胞活力对数生长期PC12细胞500个/孔接种在24孔板(Costar)中，每组细胞各铺3孔. 培养24 h后换以0, 100, 300和500 μmol/L MnCl2培养液，分别培养24, 48和72 h后，换以不含MnCl2的培养液，继续培养12～15 d，弃去培养液，PBS(0.01 mol/L, pH 7.4)小心浸洗2次. 加纯甲醇5 mL固定15 min. 弃去固定液，加适量姬姆萨应用液染色20 min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥. 显微镜下计数>50个细胞的克隆数，每组实验重复3次，计算克隆形成率及抑制率.

1.2.3Western blot检测ERK1/2及pERK1/2表达水平PC12细胞分别以含0, 100, 300和500 μmol/L MnCl2的DMEM培养基培养3 d后，用预冷的PBS吹打收集细胞，预冷的裂解液每组100 μL冰上裂解10 min，用改进的Folin酚法定量蛋白，每组样品取25 μg蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，冰水浴条件下电转. 将NC膜以50 g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h. 将ERK1/2及 pERK1/2一抗分别用封闭液按1∶1000稀释后加于NC膜上，4℃过夜；用封闭液洗膜3次×8 min，将二抗用封闭液按比例稀释后滴加于NC膜上，37℃作用1 h； TBS洗膜3次×8 min. 待NC膜稍干后，在膜上滴加1 mL化学荧光液，反应约4 min后用保鲜膜覆盖，在暗盒中用X光胶片压片成像. 后显影、定影. 图像经GeneGenius凝胶成像分析系统进行分析.

统计学处理： 实验数据均以x±s表示；使用SPSS11.0软件进行重复测量方差分析，组间比较采用Duntt检验.