低浓度α?生育酚对神经元细胞膜的保护作用(一)

【摘要】 　　目的: 探讨低浓度α?生育酚对神经元细胞膜的保护作用. 方法: 培养SD胎鼠皮层神经元细胞作为实验对象. 将神经元细胞进行分组：正常对照组、氧自由基损伤组和不同浓度α?生育酚处理组(10，20，40和80 mg/L). 用Fenton反应对神经元细胞膜造成损伤. 在损伤后1及2 h分别对各组神经元进行PI染色，利用激光共聚焦显微镜观察神经元细胞膜的损伤情况，并用TBA法检测神经元细胞外液中丙二醛(MDA)生成量. 结果: 80 mg/L浓度α?生育酚可减少氧自由基对神经元细胞膜的损伤, 且可减少MDA生成量. 结论: 80 mg/L浓度α?生育酚可以有效对抗氧自由基对神经元细胞膜的损伤.

【关键词】 α?生育酚 神经元 细胞膜 低浓度

0引言

氧自由基是引起颅脑损伤等多种中枢神经疾病继发损伤的重要因素. 而维生素E是一种天然的抗氧自由基物质. 维生素E共包括8种分子，其中α?生育酚为公认抗氧自由基最有效的〔1〕. 在近年的研究中，已证实α?生育酚可阻止氧自由基对细胞膜中多不饱和脂肪酸及膜蛋白的攻击，防止细胞膜功能的丧失〔2〕. 然而国内外学者对应用多大浓度的α?生育酚才可有效保护细胞膜有很大分歧. 本实验我们利用Fenton反应形成氧自由基对胚胎大鼠皮层神经元的损伤，观察低浓度α?生育酚对神经元细胞膜的保护作用.

1材料和方法

1.1材料α?生育酚、碘化吡啶（PI）染料（Sigma公司，美国）；2.5 g/L胰蛋白酶、0.2 mol/L EDTA、各种细胞培养液（GibcoBRL公司，美国）；MDA检测盒，购于南京建成生物公司；300 mL/L双氧水，硫酸亚铁，维生素C和无水乙醇，均为国产分析纯. 孕14 d的SD大鼠2只，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心. TE200?E型激光共聚焦显微镜观察( NIKON公司, 日本)；TG?150型二氧化碳培养箱(Jouan公司,法国)；CR?22G型离心机（日立公司，日本）；UV240型紫外分光光度计（岛津公司，日本）.

1.2方法

1.2.1α?生育酚水溶液配制取α?生育酚10 mg溶于1 mL无水乙醇中，将无水乙醇缓慢滴入49 mL 30℃去离子水中，制成200 mg/L α?生育酚水溶液母液备用. 碘化吡啶染料配制：将碘化吡啶粉末以去离子水溶解为终浓度为1 mg/L工作液.

1.2.2SD大鼠皮层神经元分离及培养将实验大鼠断颈处死，取胚胎脑皮层组织，剪碎，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 mmol/L EDTA，令其分散成单细胞悬液，过200目不锈钢网,于37℃, 50 mL/L CO2培养箱中进行培养. 隔日换液. 培养到第4日，细胞悬液于离心机中以1000 r/min速度离心10 min，去沉淀细胞，加入神经元培养液，接种于涂有鼠尾胶原的25 cm×25 cm细胞培养瓶中，使干细胞转化为神经元，隔天换药一次，第6日使用.

1.2.3实验分组将所有神经元培养瓶进行分组，共分为：正常对照组；氧自由基损伤组；不同浓度α?生育酚处理组（10, 20, 40和80 mg/L亚组，与神经元作用1 h后备用）.

1.2.4利用Fenton反应造成神经元氧自由基损伤按照Yamazaki等〔3〕方法，在培养皿中加入硫酸亚铁、维生素C和300 mL/L双氧水，使溶液中硫酸亚铁终浓度为0.2 mmol/L,维生素C终浓度为0.2 mmol/L，双氧水终浓度为0.4 mmol/L，制作氧自由基损伤模型.

1.2.5PI染色按照袁兰等〔4〕方法，将PI粉末以去离子水溶解为终浓度1 mg/L工作液. 将氧自由基损伤组及α?生育酚处理组及正常组培养瓶中加入试剂后，立即开始计时，并取反应开始后1和2 h培养瓶中的神经元进行PI染色，将PI工作液100 μL均匀滴在神经元细胞上，置于暗室中染色15 min，用pH 7.0 PBS液冲洗3遍.

1.2.6激光共聚焦显微镜观察细胞形态激光共聚焦显微镜荧光激发波长为567 nm，发射光波长大于590 nm，伪彩色采用红色，在保证信噪比的情况下尽量增大检测的pinhole和PMT. 选定5个图像清晰的视野，在200倍镜下观察. 细胞红染者为细胞膜损伤细胞，未染色者为正常细胞〔4〕. 每个视野随机计数100个神经元，记录其中有细胞膜损伤的神经元数，共记录5个视野内神经元，计算平均值.

1.2.7MDA测定采用MDA检测盒，结合紫外分光光度计，按照TBA法分别检测各组神经元培养瓶中溶液的MDA浓度. 每一次取0.1 mL溶液检测，每瓶测值为该瓶溶液的MDA浓度.

统计学处理：所有数据以x±s表示，多个样本间均数比较用方差分析，用Student?Newman?Keuls(SNK)法进行多组间两两比较. P0.05认为差异有统计学意义.

2结果

2.1神经元细胞膜损伤分析正常对照组只有极少荧光染色阳性细胞，而损伤组和α?生育酚处理组均有荧光染色阳性细胞（图1,2）. α?生育酚浓度为正常生理浓度10 mg/L时，不能有效消除Fenton反应所造成的氧自由基损伤. 而当α?生育酚达到80 mg/L时，细胞膜损伤的神经元总数减少，有统计学意义.

2.2MDA结果分析80 mg/L α?生育酚处理组MDA产生量低于单纯氧自由基损伤组（表2），但仍高于正常对照组.表1碘化吡啶染色结果比较表2不同处理组的MDA值比较