脐血造血细胞体外集落培养最佳收获时机的探讨(一)

详细内容

关键词：基质细胞;脐血;集落

　　摘要:目的探讨脐血（CB）多系造血集落培养在不同培养条件下脐血造血细胞体外扩增的最佳收获时机。方法将从新鲜CB标本中分离出的单个核细胞（MNC）分别接种于已建立的无血清培养基，该培养基分别含单用人骨髓基质细胞、单用细胞因子及细胞因子联合入骨髓基质细胞（HBMSC）支持培养体系。在0、6、10及14d各时间点分别取细胞进行巨细胞集落形成单位（CFU-MK）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）及粒单细胞集落形成单位（CFU-GM）培养。结果在体外培养过程中，第10d时各组CFU-MK、BFU-E及CFU-GM数均高于组内其它时间点（P0.05）;在含HBMSC支持培养的组集落生成数优于其它组（P0.05）。结论脐血MNC体外培养过程中，第10d可能是收获的最佳时机。FIBMSC能更好地维持造血干/祖细胞的活性，使其集落形成能数得到有效扩增。

　　关键词:基质细胞;脐血;集落

　　Observationontheoptimumtimeforharvestinghematopoietiellsfromcordbloodaftercultureinvitro.
　　
　　Abstract:ObjectiveToexploretheoptimaltimeforharvestingcordbloodhematopoietiellsculturedinvitrobycolonymulti-plication.MethodsMononuclearcellsseparatedfromcordbloodwereculturedinaserum-freesystemsupplementedwithcy-tokinesorhumanbonemarrowstromalcellsofbinationofthem.CFU-MK，BFU-EandCFU-Gmwereassessedbysemisolidcultureassayond0，d6，d10andd14fordeterminationofprogenitorunmber.ResultsThequantityofCFU-MK，BFU-EandCFU-Gmond10aftercultureweresignificantlyhigherthanthatofotherculturetime（P0.05）.Thenumberofcolonyformingunitswerehigherinthegroupssupportedwithhumanbonemarrowstromalcells（P0.05）.ConclusionTheoptimaltimeforharvestingthemononuclearcellsisonthetenthdayafterinvitrocultureofcordbloodhematopoietiells.Bonemarrowstromalcellsiscapableofmaintainingtheactivityofhematopoietiellsculturedinvitro.
　　Keywords:Stromalcell;Cordblood;Colony

　　脐血中造血干/祖细胞含量少，难以满足大多数成人造血干细胞移植重建造血及免疫功能的需要，限制了其在临床上广泛应用。通过体外培养实现脐血造血细胞的有效扩增便成为解决问题的关键。目前，脐血造血细胞体外扩增的培养体系多包含有不同的细胞因子组合和以骨髓基质细胞为滋养层以及以骨髓基质联合细胞因子等成分支持脐血体外扩增。在前期的研究中证实〔1〕，以上三种方式都可以使脐血造血细胞得到有效扩增，其中以第三种效果最好，但是造血细胞在体外培养过程中不可避免地产生过分化的现象，造成造血细胞体内移植能力的减弱。本实验通过观察扩增后造血干/祖细胞在不同时间点各系集落形成能力的变化，寻找脐血体外培养收获细胞的最佳时机。

　　1材料和方法

　　1.1人骨髓基质细胞层的建立无菌条件取出正常成人供者骨髓液约5～6ml，经淋巴细胞分离液（聚蔗糖一泛影葡胺，比重为1.077，购自中国医学科学院血液研究所）密度梯度离心制成单个核细胞（MNC）悬液，接种于含15%FBS，100kU/I青霉素，100mg/L链霉素的IMDM培养体系中。细胞接种浓度为2×106/ml，2d后全量换液，以后每周半量换液2次，培养10～14d，基质细胞层融合（约80%）后，经15Gy60Co照射备用。

　　1.2脐血MNC液体培养体系无菌采集正常足月妊娠健康产妇的脐血10例，ACDA抗凝，新鲜脐血按4:1体积比加入羟乙基淀粉30～45min去除沉淀的红细胞，经淋巴细胞分离液密度梯度离心分离山MNC悬液备用。无血清培养体系为StemspanTM培养液（Stemcell公司产品）。加入细胞因子SCF、FL及TPO浓度均为40ng/ml（英国Peprotech公司）。脐血MNC接种浓度为1×106/ml。实验分组如下:A、对照组:无细胞因子及HBMSC;B、培养液中含HBMSC:C、培养液中仅含细胞因子:D、培养液中同时含细胞因子及HBMSC，种入25cm2培养瓶于37℃，体积浓度为5%CO2的全湿培养箱中培养14d，分别在d6、d10及d14半量换液，计数细胞总数并取出细胞进行半固体集落培养。

　　1.3脐血造血祖细胞集落培养对培养前脐血MNC及每次换液细胞进行CFU-MK、CFU-GM及BFU-E集落培养。BFU-E及CFU-GM用半固体MethoCultTMGF（H4434）（Stemcell公司）培养基，含1%甲基纤维素，30%FBS，i%BSA，10-4M2-ME，50ng/mlrhSCF，50ng/mlGM-CSF，10ng/mlrhlL-3，3U/mlrhEPO，细胞接种于24孔培养板，培养14d后倒置显微镜下计数各种集落数，显微镜下以含50个细胞以上的细胞团为一个集落;CFU-MK用MethoCultTM-C试剂盒（含无血清培养液、胶原及与CD41结合的原位APAAP染色系统）检测，具体操作方法根据试剂盒说明书进行。

　　1.4统计分析运用SPSS11，0统计软件包分析，以P0.05为差异有显著性。

　　2结果

　　本实验所用半固体培养基MethoCultTMGF（H4434）可支持CFU-GM及BFU-E等集落生长，接种第1～2d倒置显微镜下观察仍为分散的单个细胞，第3d开始增殖，起初为几个细胞丛，第7d后可见集落，7～14d集落不断增多，14d后集落逐步减少，集落形成单位为含50个以上细胞的细胞团，其中CFU-GU为无色的细胞团，有的呈密集型集落，有的呈疏散型;BFU-E为粉红色集落，集落内细胞完整，细胞间紧密相连。CFU-NK经固定及染色后为呈粉红色胞膜，淡蓝色核的细胞群体，而非巨核系集落或细胞簇则仅核着色，呈淡蓝色。3个以上巨核细胞组成的细胞团称为CFU-MK。各组不同时间点集落形成单位体外扩增数，见表1。