大鼠反流性食管炎和Barrett食管基因表达谱的比较(一)
详细内容
作者：程鹏，龚均，刘贵生，汪涛，常英
【摘要】 目的: 研究Barrett食管（BE）和反流性食管炎(RE)组织基因表达谱的差异. 方法: 建立胃十二指肠混合食管反流SD大鼠动物模型，用含有4096条双点大鼠cDNA芯片分别比较BE,RE和正常食管上皮（NC） mRNA表达情况. 结果: 芯片杂交差异表达在3倍以上的基因，RE和NC杂交芯片232项，其中表达上调的基因90条，表达下调的基因142条；BE和NC杂交芯片448项，其中表达上调的基因312条，表达下调的基因136条; 相对于RE，BE表达上调的基因214条，表达下调的基因86条. 结论: BE和RE在基因表达水平上存在差异.
【关键词】 Barrett食管
0引言
近年来，食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, EA）发病率在世界范围内呈增长趋势,Barrett食管被认为是其发生的重要危险因素备受关注. 但其机制尚不清楚. 我们应用Miwa等(Int J Cancer, 1996, 67:260)方法建立胃十二指肠混合食管反流动物模型，基因芯片技术动态观察食管上皮过度暴露于胃十二指肠混合反流物中基因转录表达的改变，以期明确BE发生、发展为EA的分子生物学机制.
1材料和方法
1.1材料二级实验动物SD大鼠120只，8 wk龄, 体质量（220±20）g，购于西安交通大学实验动物中心，SPF条件雌雄分笼饲养. 大鼠雌雄配对，随机分为实验组90只，对照组30只，每组雌、雄各半. 用Miwa等方法建造十二指肠胃混合食管反流SD大鼠模型；设假手术组为对照组，开腹后游离食管下端迷走神经后关腹. 术后40 wk取材，纵行剖开食管，观察大体病变后，区分食管炎?Barrett?s食管组织，将不同病变剪开. 然后每病变组织分别取0.2 cm×0.2 cm标本，40 g/L甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察各种病变组织学特征. 其余部分与组织切片建立一一对应关系，快速分离上皮组织并于离体10 min内液氮冻存. 根据病理结果将食管炎、Barrett?s食管组织分类存放，取对照组正常食管上皮作为对照（normal control, NC），保证每种组织纯度>80%，以备基因芯片检测.
1.2方法cDNA芯片所用的4096个大鼠靶基因cDNA克隆由上海博星基因有限公司提供,以通用PCR引物扩增，PCR反应及产物纯化用标准方法进行，琼脂糖凝胶电泳监控PCR质量. 靶基因溶解于3×SSC点样液中，用Cartesian7500点样仪点于硅烷化玻片上，每个靶基因重复2点. 点样后玻片经2 h水合，室温干燥0.5 h，置于紫外交联仪中交联，再分别用2 g/L SDS，水及2 g/L硼氢化钠溶液处理10 min，晾干备用. 探针制备采用Chomczynski提出的一步法从上述组织中抽提总RNA, 用Oligotex mRNA Midi Kit(qiagen) 纯化mRNA,逆转录标记cDNA探针并纯化. 参照Schena等（Proc Natl Acad Sci USA, 1996，93: 10614）的方法逆转录标记探针并纯化，用Cy5?dUTP标记食管炎、Barrett食管组织样本cDNA, Cy3?dTUP标记对照组食管组织作为对照cDNA. 乙醇沉淀后溶解在20 μL, 5×SSC加2 g/L SDS的杂交液中. 将杂交探针和基因芯片分别在95℃水浴中变性5 min, 将探针加入基因芯片上,用盖玻片封片,置于60℃杂交15～17 h. 打开盖玻片,分别用2×SSC加2 g/L SDS, 0.1×SSC加2 g/L SDS的溶液洗涤10min,室温晾干. 采用General Scanning公司的Scan Array 3000扫描芯片, 用预先选定的内参照基因Cy3和Cy5进行标准化处理，杂交结果显示：全部阳性对照信号清楚，阴性对照信号很弱，证明实验数据可靠. 用Gene Pix Pro 3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的比值, 用40个持家基因进行Cy3和Cy5的均衡，并对Cy3进行标准化处理得出Cy3*，计算Cy5/Cy3*两者的比值用于异常表达判断. 判定基因差异表达的标准定为: ①Cy5和Cy3*的比值ratio大于3.0或小于0.33; ②有效基因的Cy3*和Cy5的值两者皆大于200或其一大于800；③PCR结果良好.
2结果
2.1基因芯片杂交信号散点图NC,BE,RE组织总RNA的A260/A280值为2~2.6，电泳结果证实，抽提到高纯度总RNA. 差异表达基因筛选,以Cy3与Cy5的荧光信号值作散点图，X轴、Y轴分别以Cy3荧光信号值（=前景值-背景值）和Cy5的荧光信号值为坐标，每一数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号，显示一个很分散的分布图形，大部分聚集在几乎为45度的对角线周围的红点代表Y值和X值的比值在0.33至3.0之间，属于非差异性表达；数据点为黄色，代表Y值和X值的比值在0.33至3.0之外，属于差异性表达.
2.2基因芯片杂交荧光扫描图基因芯片杂交差异表达显著性在3倍以上的的基因，其中RE和NC杂交芯片232项，其中表达上调的基因90条，表达下调的基因142条；BE和NC杂交芯片448项，其中表达上调的基因312条，表达下调的基因136条. BE,RE与NC比较所有差异性表达的基因去除BE,RE共同差异性表达的基因为BE与RE比较差异性表达的基因，共300条，上调表达的基因214条，表达下调的基因86条,这些基因按功能分成12大类 . BE与RE比较表达差异3倍以上的部分基因(表1，2).
表1BE与RE表达差异3倍的基因功能分类 略
表2BE与RE比较表达差异3倍以上的部分基因 略