金樱子对实验性ⅠgA肾病大鼠MCP?1mRNA表达的影响(一)

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作者：黄艳明 舒雨雁 韦玉兰

【摘要】 目的研究金樱子水醇提取液对实验性ⅠgA肾病大鼠肾组织MCP?1mRNA表达的影响，了解其作用机制。方法建立ⅠgA肾病大鼠模型，将36只动物随机分成正常组、模型组和治疗组，用RT-PCR方法检测各实验组肾脏组织MCP?1mRNA表达。结果MCP?1mRNA在3个实验组中的相对表达量分别为：(0.308 3±0.159 4),(0.873 2±0.501 7)，(0.418 2±0.193 3)，与模型组相比，金樱子治疗组能有效抑制MCP?1mRNA在肾组织的表达(P＜0.05)。结论金樱子能下调MCP?1mRNA在肾脏的表达，减少局部炎症反应，减轻肾脏损害，保护肾脏。

【关键词】 金樱子 ⅠgA肾病 单核趋化蛋白因子

　　Abstract：ObjectiveTo study the effects of Rosa laevigata Michx on expression of MCP?1mRNA in rat experimental ⅠgA nephropathy model renal tissue at level of gene which can help to understand mechanism of action. MethodsAfter IgA nephropathy model was established,36 rats were divided at random into normal group, model group and treatment group. The expression of MCP?1mRNA in renal tissue by RT-PCR methods. ResultsThe expression of MCP-1mRNA in three groups were (0.308 3±0.159 4),(0.873 2±0.501 7),(0.418 2±0.193 3) respectively. pared with model group,Rosa Laevigata Michx could inhibit the expression of MCP?1mRNA `in renal tissue(P＜0.05). ConclusionRosa laevigata Michx can decrease the expression of MCP?1mRNA in kidney, diminish local inflammatory reaction ,relieve renal loss and protect renal function.

　　Key words：Rosa laevigata Michx ; ⅠgA nephropathy; MCP?1

　　金樱子Rosa laevigata Michx含有皂苷、鞣质、甾体、萜类、多糖等生物活性物质。大量的实验证实〔1，2〕，金樱子的有效成分具有抗菌消炎、抗氧化、降血脂和增强免疫力的作用，我们已经研究了金樱子水醇提取液对IgA肾病大鼠炎症因子TGF?β的影响，实验证明该药能在转录水平上减轻细胞外基质中的胶原Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ，FN等多种成分的合成，能缓解肾脏的纤维化和肾小球的硬化。在此基础上，本课题进一步探讨该药对肾组织中单核趋化蛋白因子(monocyte chemoatracttant pretein?1,MCP?1)mRNA的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康远交系雄性SD大鼠36只，体重180～200 g，由广西医科大学实验动物中心提供；牛血清白蛋白、Trizol、逆转录试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供；葡萄糖球菌肠毒素（SEB）由军事医学科学院提供；TaqDNA聚合酶、dNTP由Takara生物公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组 动物适应性饲养1周，检测尿蛋白，随机将36只SD大鼠分成正常组12只、模型组12只和金樱子治疗组12只。

　　1.2.2 ⅠgA肾病大鼠模型的建立 除正常组外，其余各组隔日用0.1%BSA酸化水（0.1%稀盐酸配制）100 mg/kg灌服，至处死日。第6,7两周，每周连续3 d 10 mg/kg尾静脉注射1%BSA缓冲液（无菌生理盐水配制），第8～10周，1次/周,0.4 mg/kg尾静脉注射SEB（无菌盐水配制）。正常组隔日饮用酸化水，第6～10周尾静脉注射与造模等量等次的生理盐水，然后观察至第15周。

　　1.2.3 给药方法 动物给药从第11周开始，治疗组用金樱子水醇提取液按1 ml/200 g灌服；模型组和正常组每日用生理盐水灌服至处死日。其中模型组1只大鼠在尾静脉注射后第3周持续异常瘦弱摄食减少而死亡，已从实验中剔除。

　　1.3 大鼠MCP?1 mRNA检测

　　1.3.1 肾组织总RNA提取 按照总RNA提取试剂盒说明书进行。

　　1.3.2 RT?PCR引物的设计与合成：MCP-1引物由上海生工生物公司设计合成，上下游引物序列分别为5'-ATG CAG GTC TCT GTC ACG ?3'，5'?CTA GTT CTC TGT CAT ACT-3'，扩增产物长度为450 bp。β?actin引物为内参，由上海生工生物公司合成，上下游引物序列分别为5'?CTA TCG GCA ATG AGC GGT TC?3'，5'?CTT AGG AGT TGG GGG TGG CT-3'，扩增产物长度为762 bp。

　　cDNA合成：于一离心管中先加入总RNA 11 μl，随机引物1 μl,PCR反应仪70℃ 5 min ,然后按下列顺序加样：5×buffer 4 μl，dNTP(10 mM)2 μl，Ribonuclease inhibitor 1 μl，37℃ 5 min。然后加入MMULV（200 u/μl）1 μl，轻轻混匀，42℃ 温育60 min，72℃ 10 min灭活逆转录酶，-20℃保存备用。

　　多聚酶链反应：取上述各组逆转录产物按下列顺序加样：cDNA模板2 μl，TaqDNA聚合酶2U，β?actin上下游引物各1 μl，MCP?1上下游引物各1 μl，Buffer2.5 μl，dNT 1 μl，用无菌水补齐至25 μl。PCR反应仪上运行下列操作：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃30 s，72℃30 s，35个循环，72℃7 min。

　　PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳：用β-actin作内参照，紫外凝胶成像分析仪对电泳条带成像并保存，Quangtity-one分析软件分析积分光密度，计算MCP?1电泳条带的积分光密度和β-actin积分光密度的比值。

　　1.4 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件，计量资料以±s表示，采用方差分析。