高效液相色谱法测定贯叶连翘提取物中4种成分的含量(一)

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作者：许小红，廖丽云，陈龙江

【摘要】 　　目的建立高效液相色谱法（HPLC）测定贯叶连翘提取物中金丝桃素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素含量的方法。方法色谱柱为C18柱 ( 250 mm×4.6 mm，5 μm)；测定金丝桃苷、芦丁和槲皮素时,流动相为甲醇-乙睛-0.3%磷酸溶液，梯度洗脱，检测波长360 nm；测定金丝桃素时，流动相为甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液，检测波长580 nm。结果金丝桃苷，槲皮素，芦丁、金丝桃素线性范围分别为1.97～20.3 μg・ml-1 (r=0.999 2)，2.47～24.7 μg・ml-1(r=0.999 1)，2.25～22.5 μg・ml-1(r=0.999 1) , 0. 08～0.4 μg・ml-1(r=0.999 5), 方法回收率均不低于98%。结论该方法简便、准确、重复性好，可用作贯叶连翘提取物中此4种成分的含量测定。

【关键词】 贯叶连翘提取物 金丝桃素 金丝桃苷 高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo develop a rapid high-performance liquid chromatography method for determination of hypericin, hyperoside, rutin and quercetin in Hypericum perforatum L. extracts.MethodsHPLC method was employed on C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The hyperoside, rutin and quercetin were detected at 360 nm, eluted with gradient three mobile phase (methanol-acetonitrile-0.3% phosophoric acid). The Hypericin was detected at 580 nm and the mobile phase consisted of methanol and 0.02 mol・L-1 KH2PO4.Results The HPLC method showed a good linear relationship in the range of 1.97～20.3 μg/ml (r=0.999 2) for hyperoside, 2.47～24.7 μg/ml (r=0.999 1) for quercetin, 2.25～22.5 μg・ml-1 (r=0.999 1) for rutin and 0.08～0.4 μg/ml　(r=0.999 5) for hyperin. Recoveries for the four ponents were all above 98%.CondusionThis HPLC method is simple, aurate and repeatable and can be used for determination of the four ponents in Hypericum perforatum L. exatracts.

　　Key words：Hypericum perforatum L. extracts; Hyperin; Hyperoside; HPLC

　　贯叶连翘Hypericum performatum L.为藤黄科金丝桃属多年生草本植物，其味苦、辛，性平，可清心明目、调经活血、止血生肌、解毒消炎〔1〕，国外在抗抑郁症方面也有广泛应用〔2〕。贯叶连翘其提取物主要成分有金丝桃素 (hypericin)、金丝桃苷、芦丁和槲皮素等，结构式如图1。其中金丝桃素为萘骈二蒽酮类结构，在酸性溶液中溶解度极低；其余3种物质为黄酮类结构，采用HPLC测定含量时一般需偏酸性流动相，因此较难用同种方法同时测定此4种物质。金丝桃苷与芦丁均为槲皮素与不同糖苷形成的苷，采用等度HPLC分离度较难达到要求。因此本文分别建立了金丝桃素HPLC测定法与金丝桃苷、芦丁和槲皮素HPLC梯度洗脱测定法，以期为贯叶连翘提取物的质量控制及制剂的开发提供含量测定的方法。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器

　　高效液相色谱仪（Dionex,美国），包括P680四元泵、ASI-100自动进样器、UV1700型检测器，TC100柱温箱，Chromeleon工作站，PHS-3C型酸度计（上海精密科学仪器有限公司）。

　　1.2 试药金丝桃素对照品(Sigma 公司，规格1mg, 批号548-04-9)；金丝桃苷对照品（批号111521-200303），槲皮素对照品(批号100081-200406)，芦丁对照品(批号100080-200306)，均购自中国生物制品检定所。贯叶连翘提取物, 成都医学院天然药化教研室制备。甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸二氢钾、磷酸为分析纯，水为纯蒸水。

　　2 方法与结果

　　2.1 金丝桃素测定

　　2.1.1 色谱条件色谱柱Alltech C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(2∶98) (取1.36 g磷酸二氢钾，加水500 ml使溶解，用四丁基氢氧化铵溶液调pH值至6.5)；检测波长580 nm；流速1.0 ml・min-1；柱温40 ℃；进样量20 μl。理论塔板数以金丝桃素峰计不得低于3 000。结果见图2。

　　2.1.2 对照品贮备液的制备取金丝桃素对照品1 mg，置50 ml棕色量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀制得浓度为20 μg・ml-1的对照品贮备液。

　　2.1.3 供试品溶液的制备取贯叶连翘提取物粉末50 mg，置25 ml量瓶中，加入适量甲醇，超声处理30 min，加甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。