小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶载体的构建(一)

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作者：刘英， 刘运强， 周钦， 陶大昌， 彭艳， 刘合

【关键词】 ,DNA结合基因蛋白质类；,基因；,聚合酶链反应；,克隆,分子

　　摘要: 目的 构建用于小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶的载体，为产生Znf230基因敲除的小鼠模型准备条件。 方法 设计和合成引物，经PCR从小鼠的基因组中扩增出5＇同源臂、3＇同源臂及锚定序列，长度分别为4，4，1 kb的片段，反向插入pBS载体的neo基因的两侧，从而构建小鼠Znf230条件基因打靶载体Znf230pBS(5)。 结果 经过限制性内切酶及DNA测序鉴定，证实该条件基因打靶载体含有的同源序列与Genebank公布的基因序列一致，表明载体构建成功。 结论 PCR技术和定向克隆技术是构建条件基因打靶载体简单而可靠的方法。运用该技术可获得小鼠锌指蛋白基因Znf230的条件基因打靶载体。

　　关键词: DNA结合基因蛋白质类； 基因； 聚合酶链反应； 克隆，分子

　　已婚育龄夫妇不孕不育症的发病率约10%～15%，其中50%由男性不育引起。导致男性不育的因素很多,除系统疾病、营养不良、内分泌疾病、精子运送的解剖学上障碍、感染、环境毒物等外，精子发生障碍为一个重要原因,表现为无精子症或少精子症(精子数2×106 mL-1)。导致无精症的原因不详，更无有效的治疗方法。为探讨其发病机制，了解疾病的干预因素，必须具有良好的动物模型。

　　基因打靶技术是近年来迅速发展起来的新兴分子生物学技术,对胚胎干细胞(embryonic stem,ES)进行基因打靶是人为特定地修饰和改造细胞染色体遗传性状的有效方法和途径[1]。Cre/LoxP系统的引入使从时间和空间控制基因的敲除成为可能，有效的避免了胚胎发育重要基因敲除后胚胎不能存活、从而无法进行后续研究的限制[23]。条件敲除载体的构建是进行条件基因打靶关键的第一步。一般使用替换型打靶载体,在锚定序列的两侧插入同向的LoxP序列和外源性同源序列及正筛选标志基因。正筛选标志基因位于内含子中，可以帮助研究者筛选接受了外源基因的细胞，但不影响细胞和整体的正常功能。笔者尝试运用该法建立Znf230基因敲除的小鼠模型，第一步工作就是利用Cre/LoxP系统构建条件基因打靶载体。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 限制性内切酶、T4DNA连接酶购自美国纽英伦公司；高保真Taq酶(Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)和T载体(TOPO TA Cloning Kit)购自美国Invitrogene公司；pBlueScript 质粒购自美国STRATAGENE公司。胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)购自德国QIAGEN公司。质粒小量抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术公司。所用引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成；测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

　　1.2 引物设计

　　F1：5＇CAT ACG CGT GTT TGT TCT CTC TTT T T3＇

　　R1：5＇G GCT AGC T GTT ACA TAA A CAC TAG3＇

　　用来扩增5＇同源臂，并引入酶切位点MluⅠ和NheⅠ。

　　F2：5＇CAT GAG CTC CTG AGC TTG GGT CTT CAT T3＇

　　R2：5＇CTG CAA TTG GTT GAG AAT A GAG GGA TGG3＇

　　用来扩增3＇同源臂，并引入酶切位点SacⅠ和MfeⅠ。

　　F3: 5＇CAA GTC GAC GGA CTG TGT GCT TTG GTC AGC3＇

　　R3: 5＇A TGC TAA GGA CTC AGG AAG GAC ATA AAC3＇

　　用来扩增锚定序列，并引入酶切位点SalⅠ和Bpu10Ⅰ。

　　F4: 5＇GAT TAC TGG G CAT AAC TTC GTA TAG CAT AC3＇

　　R4:5＇CGA A CTC GAG CAT AAC TTC GTA TAA TGT ATG3＇

　　用来扩增带有同向LoxP序列的锚定序列，并引入酶切位点PspOMⅠ和XhoⅠ。

　　1.3 3＇同源臂的克隆

　　1.3.1 PCR扩增 以小鼠基因组为模板，利用引物F2和R2扩增3＇同源臂。反应体系如下：小鼠基因组DNA模板1 μL（1 μg），10×长片段高保真PCR缓冲液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL,20 mmol/L dNTP 8 μL,引物F2和R2各2 μL,高保真Taq酶1 μL,加水补足体系至25 μL。混匀后置PCR仪，94 ℃预变性1 min，然后采用两步法PCR按如下程序循环30次：94 ℃变性40 s→68 ℃延伸5 min。最后72 ℃延伸10 min。PCR产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.3.2 连接T载体、鉴定及酶切 PCR产物连入T载体，反应体系为PCR产物2 μL, 反应缓冲液0.5 μL, T载体PCR2.1 0.5 μL。混匀后室温孵育5 min，冰浴2 min，加入感受态大肠杆菌DH5α，混匀后置冰上30 min，42 ℃热休克30 s，加入SOC培养液130 μL后于37 ℃复苏60 min。取菌液20 μL涂板，37 ℃培养箱培养过夜，采用蓝白斑及氨苄青霉素筛选。第2 d挑选单独的白色菌斑，摇菌并用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，利用内切酶SacⅠ和MfeⅠ鉴定，选择有4 kb阳性条带的质粒测序鉴定。完全正确后大量扩增并酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离条带，胶回收试剂盒纯化4 kb目的条带。

　　1.3.3 连接、转化及鉴定 SacⅠ和ApoⅠ酶切线性化质粒pBS，取线性化质粒50 ng与目的条带按末端浓度比1∶3混合，加入10×的T4DNA连接酶缓冲液2 μL，T4DNA连接酶0.1 μL，灭菌去离子水补足体系至20 μL。室温孵育5 min，冰上放置2 min，取转化感受态大肠杆菌10 μL，菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固定培养板上，37 ℃培养箱培养过夜。第2 d挑选单克隆、摇菌并用试剂盒小量抽提质粒，利用内切酶NheⅠ鉴定。

　　1.4 5＇同源臂的克隆

　　1.4.1 以小鼠基因组为模板，利用引物F1和R1扩增5＇同源臂。反应体系如下：小鼠基因组DNA模板0.5 μL（0.5 μg），10×长片段高保真PCR缓冲液2.5 μL，50 mmol/L MgCl2 2.5 μL,20 mmol/L dNTP 8 μL,引物F1和R1各1.5 μL,高保真Taq酶0.5 μL,加水补足体系至25 μL。混匀后置PCR仪，94 ℃预变性1 min，然后按如下程序循环30次：94 ℃变性40 s→58 ℃退火30 s→68 ℃延伸5 min。最后72 ℃延伸10 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.4.2 连接T载体、鉴定及酶切 PCR产物连入T载体，反应体系及转化过程同3＇同源臂的克隆。利用内切酶MluⅠ和NheⅠ鉴定，选择有4 kb阳性条带的质粒测序鉴定。完全正确后大量扩增并酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离条带，胶回收试剂盒纯化4 kb目的条带。

　　1.4.3 连接、转化及鉴定 MluⅠ和NheⅠ酶切线性化质粒hZnf230pBS(3)，取线性化质粒50 ng，与目的条带按末端浓度比1∶3混合，连接反应体系及转化过程同3＇同源臂的克隆。第2 d挑选单克隆、摇菌并抽提质粒，利用内切酶NheⅠ鉴定。