补肾活血方对小鼠自身免疫性卵巢功能衰退的防治作用(一)

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作者：董莉, 姜琳, 孟炜, 朱南孙

【摘要】 目的：探讨补肾活血中药对小鼠自身免疫性卵巢功能早衰（premature ovarian failure, POF）的防治作用。方法：以BALB/c雌性小鼠卵巢组织制备卵巢抗原，皮下和两后脚掌多点注射免疫同种雌性小鼠建立卵巢早衰模型。分别在第1次免疫以及第3次免疫后给予补肾活血中药，灌服中药后分析阴道脱落细胞涂片，酶联免疫法检测外周血雌二醇（estradiol, E2）、卵泡刺激素（follicle?stimulating hormone, FSH）以及黄体生成素（luteinizing hormone, LH）浓度。结果：POF小鼠卵巢间质可见淋巴细胞浸润，外周血FSH和LH升高，E2下降明显（P0.05）；而补肾活血中药能减少POF小鼠外周血FSH和LH含量，提高体内E2水平，早期预防比后期治疗用药作用显著。结论：补肾活血中药主要通过纠正紊乱的生殖内分泌轴，恢复部分卵巢功能，对免疫性卵巢早衰具有防治作用。

【关键词】 卵巢功能早衰; 中草药制剂; 小鼠

　　Objective: To investigate the preventive effect of Bushen Huoxue Recipe (BSHXR), a pound traditional Chinese herbal medicine, on autoimmune premature ovarian failure (POF) in mice.

　　Methods: Ovarian antigen was prepared with the ovarian tissue of female BALB/c mice. A mouse model of POF was established by immunization injection of the ovarian antigen of isotype female mice on multiple subcutaneous sites and two posterior soles. The POF mice were treated with BSHXR after the first and third immunization. The levels of follicle?stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and estradiol (E2) in peripheral blood were detected by enzyme linked immunosorbent assay.

　　Results: Lymphocyte infiltration was appeared in ovarian stroma of POF mice. The levels of FSH and LH were eva luated and the E2 level was decreased significantly (P0.05). BSHXR could reduce the increased levels of FSH and LH, increase the level of E2 and the number of growing and mature follicles. The efficacy of early treatment was better than that of late treatment.

　　Conclusion: BSHXR can recover ovarian function in POF mice mainly by regulating the indiscriminate hormone level, and BSHXR has preventive effect on autoimmune POF in mice.

　　Keywords: ovarian failure, premature; herbal preparations; mice

　　卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）是一类严重影响妇女生殖健康及身心健康的疾病。患者于40岁前出现闭经，伴烘热、汗出、烦躁等低雌激素症状，并常伴随其他内分泌自身免疫疾患，故其治疗比较困难。POF的发病率为1%～3%，占继发性闭经的10%～20%〔1?3〕。由于病因不明，治疗颇为棘手，尚无有效措施，尤其对于特发性或自身免疫性卵巢功能衰竭的患者而言，如何减缓卵巢功能衰退的速度以恢复卵巢功能，提高生活质量，是目前生殖内分泌临床研究的一项重要课题。

　　本研究用BALB/c雌性小鼠卵巢组织制备卵巢抗原，皮下和两后脚掌多点注射免疫同种雌性小鼠建立卵巢早衰模型。分别在第1次免疫以及第3次免疫后给予补肾活血中药，检测生殖内分泌及卵巢形态学改变，探讨补肾活血方（Bushen Huoxue Recipe，BSHXR）防治POF的作用机制，为临床运用中药治疗POF提供理论及实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验动物 SPF级BALB/c雌性小鼠200只，体质量15～20 g，由上海中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号为SYXK(沪)2004?2005。

　　1.1.2 药物及试剂 补肾活血方由仙灵脾15 g、巴戟天15 g、覆盆子15 g、菟丝子15 g、蛇床子10 g、石楠叶10 g、枸杞子15 g、党参15 g、黄芪20 g、当归15 g、川芎10 g等组成，由上海中医药大学岳阳医院制剂室采用醇提法制作成合剂（相当于含生药2.5 g/ml）。卵泡刺激素（follicle?stimulating hormone, FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone, LH）及雌二醇（estradiol, E2）小鼠ELISA试剂盒为美国R&B公司生产。弗氏完全佐剂（plete Freund's adjuvant, CFA）和弗氏不完全佐剂（inplete Freund's adjuvant, IFA）购自美国Sigma公司。

　　1.1.3 仪器 JY922Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新艺科器研究所），Sigma Diagnosis酶标仪（美国Sigma公司生产）。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 卵巢抗原制备 收集BALB/c雌性小鼠卵巢组织，称质量、洗净，于Tris?HCl缓冲液中剪碎并研磨成匀浆，低温下超声粉碎5 min，低温离心（4 000 r/ min，15 min；10 000 r/min，5 min），取上清液。调整浓度，使每0.1 ml含卵巢组织20 mg。

　　1.2.2 造模方法 参考文献〔4〕制作POF模型，按每只小鼠10 mg（0.05 ml）卵巢抗原皮下多点注射免疫BALB/c雌性小鼠，建立POF模型。连续3次，每2周1次，第1次免疫加入等量CFA，第2、3次免疫加入等量IFA。

　　1.2.3 动物分组及给药 小鼠常规喂养标准颗粒饲料，采用随机数字表将80只小鼠分为正常组、模型组、预防组和治疗组，每组20只。预防组于第1次免疫后开始给药，共给药7周。治疗组于第3次免疫后开始给药，共给药3周。正常组及模型组均灌胃等量生理盐水，每周休息1 d。药物剂量按小鼠与人体表面积转换系数计算后，每只小鼠每天灌胃0.5 ml。所有动物在造模后7周（动物处死时）取材，正常组也于此时取材。

　　1.2.4 阴道脱落细胞检测 每天下午4时各组固定取3只小鼠阴道脱落细胞做涂片，置光学显微镜下观察其动情周期变化。

　　1.2.5 血清FSH、LH及E2检测 小鼠摘眼球采血，离心，取血清，按试剂盒说明书操作要求，采用酶联免疫测定法测定FSH、LH和E2含量。

　　1.2.6 卵巢组织形态学观察 称取卵巢质量后，福尔马林固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，常规HE染色，置光学显微镜下观察。

　　1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料均数用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析q检验，即Newman?Kueuls法。