黄芪蛰虫合剂体外抗乙型肝炎病毒的作用观察(一)
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作者： 党双锁，陈云茹，程延安，张正国，王宝峰，张欣，宋平
【关键词】 黄芪蛰虫合剂；HepG2.2.15细胞；肝炎病毒,乙型
【Abstract】 AIM: To eva luate the inhibitive effects of Astragalus and Thoroughfare decoction against hepatitis B virus（HBV） in vitro. METHODS: HepG2.2.15 cells, as target cells, were exposed to different concentrations of Interferon α (IFNα) or Astragalus and Thoroughfare decoction respectively. Realtime PCR was applied to quantify extracellular HBV DNA and enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) was used to assess HBsAg and HBeAg. RESULTS: The 50% inhibitory concentration (IC50) of Astragalus and Thoroughfare decoction against HBsAg, HBeAg, and extracellular HBV DNA was 1.35, 1.92 and 2.19 g/L respectively, and treatment index (TI)>3.56-5.79. αIFN had weak inhibitory effects against HBV. CONCLUSION: Astragalus and Thoroughfare decoction can inhibit HBV replication in vitro to some extent.
【Keywords】 Astragalus and Thoroughfare decoction; HepG2.2.15 cell; Hepatitis B Virus
【摘要】 目的： 观察黄芪蛰虫合剂体外抗乙型肝炎病毒 (HBV) 的作用. 方法： 以HepG2.2.15细胞为靶细胞，分别加入不同浓度的黄芪蛰虫合剂和α干扰素. 采用ELISA法及荧光定量PCR法，测定药物对细胞培养上清HBsAg, HBeAg及细胞外HBV DNA的抑制作用. 结果： 黄芪蛰虫合剂具有一定程度的抗HBV的作用，其抑制HBsAg, HBeAg及细胞外HBV DNA的50 %抑制浓度(IC50)分别为1.35, 1.92, 2.19 g/L. 治疗指数（TI）>3.56~5.79. αIFN也有抑制HBV的作用，但抑制作用较弱. 结论： 黄芪蛰虫合剂具有一定的体外抗HBV作用.
【关键词】 黄芪蛰虫合剂；HepG2.2.15细胞；肝炎病毒，乙型
我国为乙型肝感染的高发区〔1〕. 目前，尚没有理想的治疗慢性乙型肝炎的药物. 我国有数千年应用中草药治疗疾病的传统和经验，从中已发现了不少抗乙型肝炎病毒（HBV）的有效单方和复方制剂. 黄芪蛰虫合剂是基于理论研究和临床观察，将黄芪、蛰虫、党参、白术、炙甘草及枸杞这六味中药按君、臣、佐、使进行配伍而自制的复方合剂. 在临床初步试用中发现其具有恢复肝功能、提高机体免疫力、抗肝纤维化和抑制病毒复制的作用. 动物实验表明，黄芪蛰虫合剂对肝纤维化有良好的抑制作用〔2〕. 我们采用含HBV基因转染的2.2.15细胞株为靶细胞，观察不同浓度黄芪蛰虫合剂体外对HBV的抑制作用.
1材料和方法
1.1材料黄芪蛰虫合剂为自行煎煮，水浴蒸发浓缩至生药浓度为1000 g/L. 尼龙网过滤后经2000 r/min离心，过滤除菌后备用. 实验时用培养液稀释，分别配制成10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 g/L共5个浓度梯度. αIFN由深圳市海王生物工程有限公司提供，实验时分别用培养液稀释成5×105, 2.5×105, 1.25×105 IU/L. 噻唑蓝（MTT, Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO, Sigma公司）；HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒（上海华泰生物工程公司），DG5031型酶联免疫检测仪（国营华东电子管厂）；HBV DNA提取及扩增荧光检测试剂盒（广州中山大学达安基因股份有限公司），PE7700型自动荧光PCR检测仪（美国Perkin Elmer公司）；HepG2.2.15细胞由第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心张岩博士惠赠；DMEM、胰蛋白酶、L谷氨酰胺(Gibco公司)； 胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；G418 (Sigma公司)；青、链霉素（华北制药厂）.
1.2方法
1.2.1细胞培养〔3〕用含200 mL/L胎牛血清、400 mg/L G418, 1.0×105 U/L青、链霉素及0.3 g/L L谷氨酰胺的DMEM培养液培养细胞，56 g/L碳酸氢钠调pH值到7.2. 用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代. 取对数生长期状态良好的细胞，调整细胞数为1×107/L，接种于96孔板，每孔0.2 mL，于37℃, 50 mL/L CO2培养箱培养48 h，待细胞贴壁后进行试验. 两种药物按配制不同浓度分组，每一浓度设3个复孔，同时设仅加细胞培养液的空白对照. 每3日换同样浓度含药培养液及对照培养液1次. 各孔用药第3, 6, 9日将吸去的上清液置于-20℃冰箱保存待检.
1.2.2药物对细胞毒性试验采用MTT法. 于加药第9日吸去上清液，每孔加5 g/L MTT 20 μL, 37℃培养4 h，弃上清液后每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，测A490 nm值. 计算细胞存活率，按下列公式计算半数中毒浓度（TC50）〔4〕. 细胞存活率（%）=（实验组A490 nm值/阴性对照组A490 nm值）×100%. TC50=Anti log〔logB+(50-B)的抑制百分率〖〗(A-B)的抑制百分率×C〕. （A=＞抑制50%药物浓度，B=＜抑制50%药物浓度，C=log稀释倍数）.
1.2.3HBsAg, HBeAg测定使用双抗体加心ELESA法. 根据试剂盒说明测定培养上清液HBsAg, HBeAg，记录P/N值，按下列公式计算50%药物抑制浓度（IC50）. 抗原抑制率（%）=（对照孔P/N值-实验孔P/N值）/（对照孔P/N值-2.1）×100%. IC50=Anti log〔logB+(50-B)的抑制百分率〖〗(A-B)的抑制百分率×C〕（A=＞抑制50%药物浓度，B=＜抑制50%药物浓度，C= log稀释倍数）.
1.2.4细胞培养上清HBV DNA检测采用Taq man荧光定量PCR法检测. 按照HBV核酸扩增荧光检测试剂盒说明操作. 引物序列为P1: 5＇ATTGCTGCTATGTCATCTT 3＇; P2: 5＇ACAGTGGGGGAAAGCTACGAA 3＇；荧光探针序列为: 5＇TGGCTAGTTTACTAGTGATTTG 3＇. 各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增： 93℃ 2 min预变性，然后93℃ 45 s到55℃ 1 min循环扩增10个循环，再按93℃ 30 s到55℃ 45 s循环扩增，共30个循环. 反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果. 计算HBV DNA抑制率. HBV DNA抑制率（%）=（阴性对照组HBV DNA拷贝数-实验组HBV DNA拷贝数）/阴性对照组HBV DNA拷贝数×100%.
1.2.5治疗指数的计算HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)=半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(IC50). 其中TI≥2为有效低毒；1 统计学处理： 数据以x±s表示，应用SPSS统计软件进行分析，组间比较采用方差分析，实验组和对照组比较采用LSDt检验. 2结果 2.1药物对HepG2.2.15细胞毒性测定黄芪蛰虫合剂不同浓度组的细胞存活率显示，黄芪蛰虫合剂对细胞的毒性作用非常小，其10, 5 g/L的抑制率分别为59.7%, 32.3%, TC50为7.8 g/L. αINF仅在浓度达5×105 IU/L时细胞存活率为48%，其余浓度对细胞生长未见明显毒性. 2.2药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBsAg, HBeAg的抑制作用黄芪蛰虫合剂的不同浓度对HBsAg, HBeAg分泌均有一定的抑制作用，且随剂量的增加、治疗时间的延长对HBV的抑制也随之增强. 计算第9日HBsAg的IC50为1.35 g/L, HBeAg的IC50为1.92 g/L. αINF抑制HBV分泌抗原的能力较弱（表1）.