地锦草提取物体外抗真菌作用研究(一)

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作者：李治建，古力娜・达吾提，斯拉甫・艾白

【摘要】 目的对地锦草提取物进行体外抗真菌实验，测定其最小抑菌浓度(MIC)值。方法采用美国临床实验室标准化委员会(NLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)，测定地锦草提取物对60株临床常见皮肤癣菌的MIC。参考MIC结果，选取地锦草提取物敏感的6株皮肤癣菌按文献方法进行杀菌试验。结果地锦草提取物对红色毛癣菌的MIC范围为128～1 024 μg・ml-1，平均MIC为446 μg・ml-1；对石膏样毛癣菌的MIC范围为128～1 024 μg・ml-1，平均MIC为539 μg・ml-1。杀菌结果显示，6株皮肤癣菌均生长，表明地锦草具有抑菌作用，其抗真菌作用是通过抑制真菌生长而发挥作用的，而不具有杀菌作用。结论地锦草提取物体外实验对真菌的生长具有抑制作用。

【关键词】 地锦草提取物； M38-A方案； 体外抗真菌； 最低抑菌浓度

　　Abstract：ObjectiveTo examine the antifungal effect of Dijincao extract in vitro and to measure the minimum inhibitory concentration(MIC). MethodsAording to the standard approved by the National mittee for Clinical Laboratory Standards(NLS) : Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi(M38-A), the MICs of Dijincao extract against 60 strains of mon clinical dermatophytes were determined.Aording to those MICs, 6 strains of dermatophytes being sensitive to Dijincao extract were selected, and germicidal test was conducted aording to the method in documents. ResultsThe MIC range of Dijincao extract against Trichophyton rubrum was 128～1 024μg・ml-1，mean MIC was 446μg・ml-1；the MIC range of Dijincao extract against Trichophyton mentagrophytes was 128～1 024μg・ml-1，mean MIC was 539μg・ml-1. The result of germicidal test showed that all the 6 strains of dermatophytes grew. ConclusionDijincao extract has antifungal activity against the dermatophytes in vitro.

　　Key words：Dijincao extract; M38-A; Antifungal in vitro; MIC

　　地锦草，维吾尔名为夏塔热其尼（Xiahatereqini）、雅丽蔓（Yalmankulake），为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.或斑地锦Euphorbia maculata L.的干燥全草，是维吾尔医常用药材，临床主要用于治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病〔1〕。研究发现，地锦草提取物具有抗细菌作用，但其抗真菌方面的研究和文献报道较少。为了研究地锦草提取物的体外抗真菌的作用，我们参照美国临床实验室标准化委员会(NLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)〔2〕，探讨地锦草提取物的体外抗真菌活性。

　　1 材料

　　1.1 药物地锦草提取物(DJC)，由自治区维吾尔医药研究所药剂室提供。提取方法及质量控制，参照《中华人民共和国药品标准-维吾尔药分册》中百癣夏塔热片之地锦草提取方法及质量控制〔3〕。阳性对照药特比萘酚(Terbinafine，TBF，商品名：Lamisil)，由诺华公司提供，批号010482，纯度99.9%。

　　1.2 菌种红色毛癣菌(Trichophyton rubrum，T.r)20株；石膏样毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes，T.m)40株；质量控制菌株为近平滑念珠菌(Candida parapsilosis，C.p)1株。本实验所采用的菌株，均来自新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库(XYZ)。

　　1.3 培养基RPMI-1640培养基，美国sigma公司产品；三氮吗啡琳丙磺酸（MOPS），美国sigma公司产品；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，批号20070825，北京奥博星生物科技有限公司产品。

　　RPMI-1640培养基的配制：将10.4 g RPMI-1640和34.53 g MOPS粉末溶于900 ml蒸馏水中，用1 mol・L-1 NaOH溶液调整其pH至7.0(25 ℃)，加蒸馏水定容至1 L，G-6漏斗滤过灭菌，存于4 ℃冰箱备用。

　　PDA培养基的配制：称取PDA 粉末38 g，加入1 000 ml蒸馏水中，摇匀加热煮沸溶解，121℃高压灭菌20 min，分装，4 ℃保存，备用。

　　2 方法

　　2.1 MIC的测定根据NLS推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)〔2〕，测定DJC提取物对T.r、T.m的最低抑菌浓度值(MIC)。

　　2.1.1 抗真菌药物储备液、稀释液的制备称取DJC粉末204.8 mg，用1 ml 二甲基亚砜(DMSO)溶解，制成浓度为204 800 μg・ml-1的储备液，存于-20 ℃冰箱备用；称取TBF 8 mg，用1 ml DMSO溶解，制成浓度为8 000 μg・ml-1的储备液。从中吸取1 μl加RPMI-1640培养基499 μl，使之稀释500倍，此时TBF储存液浓度为16 μg・ml-1，存于-20 ℃冰箱备用。

　　将DJC储备液、TBF储备液分别用RPMI-1640培养基倍比稀释成2倍终浓度。DJC的2倍终浓度由高向低依次为：2048，1024 ，512，256，128 ，64，32，16，8，4 μg・ml-1；TBF的2倍终浓度由高向低依次为：0.16，0.08，0.04，0.02，0.01，0.005，0.002 5，0.001 25，0.000 625，0.000 312 5 μg・ml-1。

　　2.1.2 菌接种液的制备

　　皮肤癣菌：将受试的皮肤癣菌接种于马铃薯培养基(PDA)上，26℃培养7～14 d。吸取2 ml无菌的0.85%的NaCl溶液，冲洗菌落表面的菌丝和孢子，将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数，将其浓度调至l×105～5×105 cfu.ml-1之间，用RPMI-1640培养基稀释50倍至2倍终浓度。

　　念珠菌：将受试的念珠菌接种于马铃薯培养基(PDA)上，36 ℃培养48 h。挑取菌落，加入2 ml无菌的0.85%的NaCl溶液中，用0.5# McFarland standard 比浊管比浊，用RPMI-1640液基稀释100倍后再稀释20倍至2倍终浓度。