半枝莲醇提物对肝纤维化大鼠TGF-β1的影响(一)

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作者：李中华，赵晓芳，李?，余胜民

【摘要】 目的探讨半枝莲醇提物抗肝纤维化的作用机理。方法采用l4复合因素大鼠肝纤维化模型造模方法制作大鼠肝纤维化模型,观察研究半枝莲对肝纤维化大鼠血清透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、IV型胶原(Ⅳ.C)含量及通过免疫组化图像分析肝组织转化生长因子β1(TGF-β1)的含量及不同剂量与疗效的关系，并探讨半枝莲醇提物抗肝纤维化的可能机制。结果半枝莲能显著抑制大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、IV.C、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的表达及免疫组化图像分析TGF-β1含量。肝纤维化评分明显降低(P0.05)。结论半枝莲具有治疗肝纤维化的作用,其机理可能与抑制肝组织中TGF-β1的合成有关。

【关键词】 半枝莲; 肝纤维化; 转化生长因子-β1

　半枝莲为唇形科植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的全草，微苦，凉，通气道、水道，有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛、利尿和抗癌等作用，用于咽喉肿痛、肿瘤、阑尾炎、肝炎、肝硬化腹水、肺脓疡、吐血、衄血、血淋、肾炎水肿等[1]治疗;据《中华肿瘤治疗大成》记载，半枝莲主治原发性肝癌等消化道肿瘤、肺癌及子宫颈癌妇科肿瘤等，在广西民间有用其治疗肝炎、肝纤维化的用药习惯。为了探讨其机理,本实验研究了半枝莲对四氯化碳致大鼠肝纤维化模型的作用。

　　1 材料

　　1.1 动物Wistar雄性大鼠72只,清洁级,体质量(220±30)g,由广西医科大学医学院实验动物中心提供,动物合格证号:桂医动字第2008324号。

　　1.2 药品与试剂半枝莲原料,由南宁市医药公司提供,经广西中医学院药学院生药教研室刘寿养教授鉴定确认后,粉碎为粗末(Φ1～3mm)并用70%乙醇提取半枝莲溶液。四氯化碳:AR级,由广西桂林生科精细化学品公司生产,批号:20080513。秋水仙碱(Colchicine)德国进口,上海医药公司分装,批号:1155-2009。谷丙转氨酶(ALT)试剂盒,谷草转氨酶(AST)试剂盒均是桂海科技试剂公司产品(批号: 20090303)。TGF-β1 ELISA试剂盒由上海森雄科技实业有限公司生产。

　　2 方法

　　2.1 动物分组健康清洁级Wistar雄性大鼠72只,体质量220～250g,随机取10只作为正常对照组(A组)。剩余大鼠进行肝纤维化造模,于第4周末A组及造模大鼠各随机处死2只证实肝纤维化形成后,将其余造模大鼠随机分为病理模型组(B组)、半枝莲醇提物溶液低剂量、中剂量、高剂量治疗组(C、D、E组)、秋水仙碱对照组(F组)共5个组,每组10只。

　　2.2 造模方法本实验采用l4复合因素大鼠肝纤维化模型造模方法,方法参照刘强等法[2]给Wistar大鼠首次皮下注射l45 ml/kg体质量,以后皮下注射40% l4花生油3 ml/kg,2次/周,共6周。但有所改进:采用高脂低蛋白食物(用玉米面为饲料,加0.5%胆固醇,实验第1、2周加20%猪油), 10%酒精为唯一饮料,皮下注射l4(第1次用0. 5 ml/100 g体质量,以后每隔3 d皮下注射40% l4油剂0. 3 ml/100 g体质量)。为了防止肝脏自然修复对实验结果的影响,各组于用药开始后仍每周注射40%l4油剂0. 3 ml/100 g体质量1次(A组除外)。

　　2.3 给药方法A组正常饲料喂养,同等容积花生油皮下注射4周后灌胃与治疗组同容积的生理盐水;B组造模4周后灌胃与治疗组同体积的生理盐水;C组:造模4周后灌服半枝莲0.25 g/100 g体质量;D组造模4周后灌服半枝莲0.5 g/100 g体质量;E组造模4周后灌服半枝莲1.0 g/100 g体质量; F组造模4周后灌服秋水仙碱10 μg/100 g体质量。以上各组灌胃液体量为1 ml/100 g体质量,1次/d,共12周,其浓度及等效剂量按体表面积折算。

　　2.4 观测指标及测定方法

　　2.4.1 肝纤维化血清指标检测A，B，C，D，E，F各组分别于用药治疗后12周,禁食12 h后称重,用10%水合氯醛腹腔麻醉,腹主动脉采血,用真空负压采血管收集,室温静置1.5 h,以2 500 r/min离心15 min,取上层血清,分装于离心管中;用AU5400全自动生化分析仪测定血清ALT、AST;用放免法测定血清HA、LN、PCⅢ、 IV.C (严格按试剂盒说明书进行操作)。

　　2.4.2 常规病理学检查将各组石蜡切片均作常规HE染色,光镜下观察肝组织改变及胶原纤维的分布,同时采用王宝恩等[3]肝纤维化的分级法进行人工量化。

　　2.4.3 免疫组织化学检查将取出的肝组织用多聚甲醛固定24h，梯度脱水之后透明石蜡包埋.采用热修复抗原SABC染色程序，切片浸入0.01 mol/L构椽酸缓冲液，微波炉加热沸腾15 min热修复，冷却后0.01 mol/L PBS溶液洗涤3次，滴加二抗及血清封闭液，室温20 min，滴加稀释一抗，4℃冰箱保存过夜，滴加SABC试剂，DAB显色，蒸馏水清洗，苏木素轻度复染，梯度脱水、透明、封片，光镜观察，每次染色时用试剂公司提供的TGF-β1阳性片作阳性对照，PBS代替第一抗体作为阴性对照。TGF-β1免疫组化结果均使用美国CMIAS专业图像分析软件测定平均光密度值，用背景的光密度值减去阳性部位的光密度值即为阳性部位的吸光度值。

　　2.5 统计方法 上述各项指标均计算±s,用统计软件SPSS11.5进行方差分析及非参数检验。

　　3 结果

　　3.1 动物生存状态观察模型组大鼠精神萎靡不振,皮毛枯槁干涩,喜静少动,动作迟缓;造模2周左右体质量开始下降。正常组大鼠皮毛浓密、光洁,体态正常，体质量日渐增加。各药物组大鼠状态较正常组稍差,比模型组明显改善。造模结束后,模型组有5只大鼠死亡,余组均存活。

　　3.2 肝组织纤维化分级[3]肝纤维化程度分级如下。0级:无胶原纤维组织增生;Ⅰ级:汇管区有少量纤维组织增生,纤维组织短而细;Ⅱ级:汇管区有较多纤维组织增生;Ⅲ级:汇管区有大量纤维组织增生,呈窄带状,并向肝小叶周围伸展;Ⅳ级:汇管区有大量纤维组织增生,呈宽带状,伸展包绕或分割肝小叶,中央静脉有偏位现象。结果见表1表1 各组肝组织纤维化分级结果只

　　3.3 肝纤维化指标(血清中HA，LN，PCⅢ，IV.C)的变化见表2。与正常组相比，模型组动物血清中的HA，LN，PCⅢ，IV.C显著升高(P0.01);与模型组相比半枝莲高、中剂量组血清中的HA，LN，PCⅢ， IV.C显著降低(P0.01); 半枝莲低剂量组血清中的PCⅢ、 IV.C显著降低(P0.05);秋水仙碱组血清中HA、LN、PCⅢ、 IV.C亦显著降低(P0.05)。结果见表2表2 各组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ.C含量检测结果　　3.4 肝功能检测结果与正常对照组比较，肝纤维化模型组血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)显著升高(P0. 01);与模型组相比，半枝莲高、中、低剂量组治疗后，血清ALT和AST显著下降(P0. 05);秋水仙碱组血清中的ALT显著降低(P0. 05)。结果见表3。

　　3.5 TGF-β1免疫组化结果正常对照组未见TGF-β1阳性染色。模型对照组大量TGF-β1阳性染色见于纤维间隔中的炎症细胞周围，其中少数胞浆中呈阳性染色。秋水仙碱组TGF-β1阳性染色程度较模型组有所减轻，纤维间隔中炎症细胞、间质细胞胞浆内阳性染色明显减弱，细胞周围的阳性染色亦有不同程度的减轻。半枝莲各剂量组组TGF-β1阳性染色程度较秋水仙碱组明显减轻，纤维间隔中的炎症细胞内有少量阳性染色，大剂量组的阳性染色稍弱于中剂量组。各组TGF-β1含量图像分析测量结果见表4表3 半枝莲对肝纤维化指标的影响表4 实验各组TGF-β1含量图像分析测量结果