含有非甲基化CpG的双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响(一)

详细内容

作者：安蔚，赵苗青，李雅林，李松，康莉，宋文刚

【关键词】 甲基化

　　Stimulatory effect of bifidobacteria DNA containing unmethylated CpG motifs on maturation of bone marrowderived dendritic cells

　　【Abstract】 AIM: To explore the effect of bifidobacteria DNA containing unmethylated CpG motifs (CpG DNA) on the maturation of bone marrowderived dendritic cells (BMDC). METHODS: The genomic DNA of bifidobacteria was extracted and purified, and the methylated degree of CpG motifs was tested. Cell phenotypes and antigens uptake of BMDC were analyzed by flow cytometry. The levels of IL6, IL12(p40) and TNFα were detected by ELISA and T cell proliferation was detected by 3HTdR incorportation test. RESULTS: Treated with bifidobacteria DNA for 24 h, BMDC expressed a high level of Ia, CD40, CD86 and CD11c molecules, significantly increased the secretion of IL6, IL12 (p40) and TNFα and significantly enhanced the pro
liferation of allogenic and homogenic T cells. CONCLUSION: Bifidobacteria DNA has remarkable stimulatory effects on BMDC maturation and antigenpresenting function.

　　【Keywords】 bifidobacteria DNA; dendritic cells; mice

　　【摘要】 目的： 探讨双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)成熟的影响. 方法： 纯化提取双歧杆菌DNA，并鉴定DNA制品CpG基序甲基化程度；FACS检测BMDC的吞噬功能和表面标志分子，ELISA法检测BMDC分泌细胞因子水平，3HTdR掺入法检测T淋巴细胞增殖能力. 结果： 双歧杆菌DNA诱导24 h后BMDC高表达Ia, CD40, CD86和CD11c分子，明显增加IL6, IL12(p40), TNFα的分泌，显著增强同种异体和自体T细胞增殖的能力. 结论： 双歧杆菌DNA能够促进BMDC成熟，增强BMDC的抗原提呈能力.

　　【关键词】 双歧杆菌DNA；树突细胞；小鼠

　　0引言

　　树突状细胞(dendritic cells, DC)是机体功能最强的专职抗原提呈细胞，它能高效摄取、加工处理和提呈抗原，有较强的迁移能力，并能显著地激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节〔1-2〕. DC是否成熟对其功能的发挥十分重要. 近年来研究表明, 细菌脂多糖（LPS）具有明确的诱导DC成熟并影响其功能的作用〔3〕，由此设想同样来自细菌含有CpG的DNA很可能对DC分化发育和功能有一定的影响. 我们利用我室提取的双歧杆菌基因组DNA (bifidobacteria DNA, B DNA)，观察了其对小鼠骨髓树突状细胞(bone marrowderived dendritic cell, BMDC)成熟的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　小鼠重组GMCSF, IL4购自Promega 公司，LPS, 小牛胸腺DNA (Calf thymus DNA,CT DNA), DextranFITC购自Sigma公司，溶菌酶、限制性内切酶HpaⅡ购自中国医学科学院友谊公司，小鼠IL6, IL12(p40), TNFαELISA检测试剂盒购自R＆D公司，RPMI 1640完全培养基RPMI 1640（Hyclone公司）, 100 mL/L胎牛血清（Hyclone公司）组成，4℃保存备用；3HTdR购自Amersham公司，抗小鼠CD4(Gk1.5), CD8（2.43）, B220（RA3.3A1/6.1）, Iab(B212)单克隆抗体杂交瘤细胞株均购自AT，不同荧光素标记的大鼠抗小鼠单抗CD11cPE, CD40FITC, CD86PE, IabFITC及FITC或 PE标记的同型对照抗体均购自PharMingen公司，4℃保存. C57BL/6（H2Kb）小鼠60只，Balb/c（H2Kd）小鼠24只，6～8 wk，体质量18～20 g,雌性，上海必凯实验动物有限公司提供. 双歧杆菌菌株引自山东省卫生防疫站并通过细菌鉴定.

　　1.2方法

　　1.2.1B DNA的制备与鉴定〔4〕将双歧杆菌接种于硫乙醇酸盐肉汤中，置厌氧培养箱37℃培养72 h，收集细菌，加入溶菌酶(1 g/L)与100 g/L SDS(终浓度为10 g/L)裂解菌体；饱和酚抽提去除菌体蛋白，透析，用紫外分光光度计测定所提取的B DNA A260 nm/A280 nm为1.823，测定DNA浓度后经薄板层析证实所制备的B DNA中无LPS存在. B DNA与HpaⅡ酶作用后电泳结果显示，细菌DNA可被顺利切割成小片段，表明所制备的B DNA具有一定的非甲基化CpG基序，冷冻干燥后备用.

　　1.2.2小鼠BMDC的培养扩增〔5〕颈椎脱位法处死C57BL/c小鼠，无菌取股骨，冲洗出骨髓细胞，加TrisNH4Cl裂解液室温作用3 min，溶除红细胞，Hanks液洗2次，加入大鼠抗CD4, CD8, Iab, B220单抗混合液，抗体终浓度均为10 mg/L, 4℃孵育45 min, Hanks液洗1次，加入含20 g/L BSA的RPMI 1640培养基及Hepes 25 mmol/L沉悬细胞，再加入兔低毒性补体（10∶1稀释），37℃水浴45 min溶除T, B及Ia+细胞，Hanks洗2次，以1×106细胞/孔加入24孔板培养，加mGMCSF 10 μg/L, mIL4 1 μg/L，培养3 d后，吸弃培养基及悬浮细胞，重新加入含有mGMCSF, mIL4的新鲜RPMI1640完全培养基，继续培养2 d 后，吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，收集后BMDC以1×106细胞/孔加入24孔板培养，分别加入B DNA (10 mg/L), LPS(1 mg/L), CT DNA (10 mg/L), PBS置37℃, 50 mL/L CO2培养24 h后，收集BMDC和培养上清待测.

　　1.2.3流式细胞仪检测BMDC表面标志和内吞能力收集培养各处理组BMDC，用PBS悬浮为1×109细胞/L，加入离心管，100 μL/管，分别加入荧光标记抗体Ia, CD40, CD86, CD11c，终浓度为5 mg/L，置4℃标记45 min，PBS洗2遍，以荧光标记的同型Ig作为对照；用流式细胞仪（FACS calibur，BD公司）CellQuest软件检测和分析BMDC表面标志. 收集培养各处理组BMDC，铺24孔培养板（2.5×105细胞/孔/500 μL）,然后加入预冷DextranFITC ，终浓度为25 mg/L，置37℃, 50 mL/L CO2孵育30 min，对照细胞加入DextranFITC后仍置于冰上孵育30 min. 预冷PBS洗细胞2次后，以流式细胞仪检测BMDC的荧光程度. FITC的绿色荧光的平均荧光强度（Geo mean）代表DC吞入胞内的DextranFITC的含量，从而反映DC对外来抗原的内吞能力.

　　1.2.4ELISA法检测BNDC分泌细胞因子的水平收集培养各处理组BMDC培养上清，采用ELISA法，按试剂盒说明书，在酶标仪上读取不同浓度的标准品相应的A450 nm值，绘制标准曲线，并进行直线相关回归分析，得出IL6, IL12 (p40 )和TNFα直线回归方程分别为： Y=0.0007X+0.0589, Y=0.0019X+0.0891, Y=0.0008X+0.1069. 将测得的不同培养上清的A值代入相应的直线回归方程中，得到相应的细胞因子的含量.

　　1.2.5混合淋巴细胞反应采用的3HTdR掺入法检测BMDC刺激同种异体或自体T细胞增殖反应的能力〔5〕. 取正常Balb/c小鼠或C57BL/6小鼠脾脏，制备无菌的脾细胞悬液，以RPMI 1640完全培养基悬浮，注入尼龙毛柱，置37℃, 50 mL/L CO2孵箱培养1 h，冲出非黏附的细胞即为纯化的T细胞，调节其密度至2×109/L，加入96孔圆底培养板，100 μL/孔；收集培养各处理组BMDC分别以30 Gy γ放射线灭活后，以2×104 (1∶10) /(孔?μL)分别加入到已含有反应细胞的各孔中，总体积200 μL，每组3个复孔. 置37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养96 h，于培养结束前16 h加入3HTdR（18.5 kBq/孔）. 收集细胞,液闪计数仪检测Bq值，结果以三个孔的平均值表示.

　　采用PEMS 3.0统计软件分析数据，数据用x±s表示，根据资料性质及特征应用方差分析，各组均数两两比较用SNKq检验.