水溶苯胺蓝褪色光度法测定壳聚糖的含量(一)

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作者：马卫兴　王敏　朱鹏　周亚文

【摘要】 目的建立壳聚糖的含量测定新方法。方法利用分光光度法研究壳聚糖与水溶苯胺蓝的超分子反应条件，并建立分析方法。结果在pH 2.21时水溶苯胺蓝与壳聚糖发生了超分子褪色反应，所拟方法用于壳聚糖的测定，结果与溴甲酚绿法一致。结论所拟方法简单，快速，用于壳聚糖的测定结果准确、可靠。

【关键词】 壳聚糖；水溶苯胺蓝；光度法

　　壳聚糖(CTS)是自然界中唯一的碱性多糖，它是天然产物甲壳素经化学法处理脱乙酰基后的产物〔1〕，其安全无毒，因分子中含有丰富的亲水性氨基和羟基而具有良好的生物活性、生物相容性、易成膜性和配位性等而具有多种用途，应用范围广泛，因有保健作用而用作保健品。目前，测定壳聚糖含量的方法有茜素红S荧光熄灭法〔2〕、电化学法〔3，4〕和光度法〔5～9〕。但未见水溶苯胺蓝用于壳聚糖的测定。实验发现，在pH=2.21时，壳聚糖与水溶苯胺蓝能形成在610 nm处有最大褪色吸收的超分子复合物，详细研究了反应条件，建立了测定壳聚糖的新方法，用于保健胶囊中壳聚糖的测定，结果与溴甲酚绿法〔5〕一致。

　　1 仪器与试剂

722N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；BS-210型万分之一的电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

100 μg/ml的壳聚糖标准溶液：称取0.100 0 g壳聚糖，置于烧杯中，用0.5 mol/L的醋酸溶解，转入1 000 ml容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，备用；5×10-4 mol/L水溶苯胺蓝溶液：称取水溶苯胺蓝0.184 4 g，置于烧杯中加水溶解，转入500 ml容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，备用；pH=2.21 Britton-Robinson缓冲液〔10〕。

　　2 方法

　　准确移取适量100 μg/ml的壳聚糖标准溶液，置于10 ml的洁净比色管中，依次加入0.75 ml 5×10-4 mol/L水溶苯胺蓝溶液，2.00 ml pH=2.21 Britton-Robinson缓冲液，再用水定容至刻度线，摇匀。同时配制试剂空白溶液，以测定溶液为参比，用1 cm比色皿在波长610 nm处测定试剂空白的吸光度A。

　　3 结果与讨论

　　3.1 测试波长的选择

　　准确移取100 μg/ml的壳聚糖标准溶液1.0 ml，置于10 ml的洁净比色管中，以下同“方法”项下操作,在波长为500～700 nm范围内测定溶液的吸光度，并绘制吸收光谱；同时配制试剂空白溶液，同样绘制吸收光谱，结果如图1所示，以水为参比时试剂空白水溶苯胺蓝的最大吸收波长在600 nm处，以水为参比的测定液的最大吸收波长在570 nm处，而以测定液为参比的相应试剂空白的最大吸收波长在610 nm处，说明壳聚糖与水溶苯胺蓝之间的反应是褪色反应，褪色的最大吸收波长与水溶苯胺蓝相比，仅红移10 nm。故选择610 nm为测试波长。

　　3.2 pH的影响

　　通常显色反应中酸度或pH是影响反应的重要因素之一。为此考察了pH值对反应的影响。对于在“方法”项下，其它条件不变，仅改变试液的缓冲溶液pH值，结果如图2所示，结果发现随着体系pH的升高，体系的吸光度逐渐变大；pH在1.89～2.36范围内体系的吸光度最大且稳定。当pH大于2.36是吸光度变小。故选择测试波长的选择pH=2.21 Britton-Robinson缓冲液来控制体系的酸度。实验还发现pH=2.21 Britton-Robinson缓冲液用量在0.50～1.25 ml内时体系吸光度最大且稳定，故选用1.00 ml。

　　3.3 试剂用量的影响

　　水溶苯胺蓝作为壳聚糖的褪色标记试剂，它的加入量直接影响反应体系中超分子复合物的生成，对于100 μg/ml的壳聚糖来说，在“方法”项下，其它条件不变，仅改变水溶苯胺蓝溶液的用量，实验结果如图3所示，随着水溶苯胺蓝用量的增加，体系的吸光度逐渐增大；当其用量在0.75 ml时体系的吸光度最大且稳定；当其用量超过1.00 ml时体系吸光度反而变小。故选用0.75 ml 5×10-4 mol/L水溶苯胺蓝溶液作为壳聚糖的标记试剂。