微精子冷冻技术帮你解决
详细内容
篇一:《牛冷冻精液配种技术操作存在的问题及改进措施》
牛冷冻精液配种技术操作存在的问题及改进措施
牛冷冻精液配种技术在我国推广应用已有30多年的历史了。冷冻精液配种技术的应用对我国牛品种的改良和培育及遗传品质和生产性能的提高都发挥了重要作用。在良好的饲养管理条件下，一般第一情期受胎率达50%以上，年总受胎率可达85-90%，甚至95%以上。但是还有一些奶牛场或配种点的牛群受胎率偏低，影响了繁殖生产。影响牛群受胎率的因素很多，包括营养和管理因素、生理因素、环境和遗传因素及产科疾病因素等，其中由于人工授精技术员操作中存在问题造成受胎率低和母牛难孕是一个不容忽视的原因。根据笔者多年现场观察操作和对基层技术员培训中，发现有如下问题。
1.无菌概念差、卫生存在问题
这是部分掌握直肠把握输精技术的配种员存在的主要问题。在工作环境、使用器具、个人卫生、精液解冻和输精过程中不同程度地存在细菌污染。
工作房间卫生
有些配种点的精液保存和解冻操作的工作房间简陋、封闭不严、室内卫生差；由于未经常打扫，房顶、墙壁、地面和桌面不洁，房间内尘土多；有些配种室与兽医室或库房混用，不良气味或杂物多。
1.2器具卫生
使用的器具不及时清洗和消毒，或清洗消毒过的器具来保存在干净密封的容器内，造成再次污染。
1.3个人卫生
配种员不注意个人卫生，工作开始前不洗手，穿着沾有牛粪和许多尘土的工作服在室内操作精液解冻。还有一些人在室内吸烟，工作时房间内充满了烟味，以上这些问题直接影响了工作环境的卫生和无菌条件，人工授精的操作很容易受到污染。
2.不卫生的操作习惯
2.1器具放置
将器具放置在桌面上，认为抹布擦过的桌面即是干净无菌的。还有一些人认为日常使用的未经消毒的白纱布或普通毛巾是无菌的，将器具放在上面或用于包裹无菌的器具。
2.2用手触摸应保持无菌的部位
认为手是干净无菌的，用手触摸器具要接触精液和子宫的部位，其实手不是无菌的，
即便是洗了手或用酒精消毒，与辐射消毒、高压无菌或蒸煮灭菌过的无菌状态相差很远。
2.3牛外阴的清洗
个别配种员清理直肠宿粪后，不擦洗外阴，就直接将输精器插入母牛阴道，将病菌甚至牛粪带入阴道。另外一些配种员用水或消毒液清洗牛外阴后，未擦干即插入输精器，阴门存留的清洗液进入了输精器头部影响精子的火力。还有些配种员用毛军擦洗牛外阴，沾染了牛粪的毛巾无法彻底洗干净，反复使用后成为污染源。
推荐方法：用自来水管或水壶的干净流水中，用刷子或带手套的手擦洗，洗去粪迹后，用纤维较粗、较厚的卫生纸擦干。擦洗牛阴门时，先擦洗阴门裂中部，再向外擦，卫生纸的一面擦了一次后，换一个面再擦。取水不方便时，可用卫生纸干擦，将可擦去的赃物擦掉。干擦法是国外普遍采用的方法。不论采用哪种方法，关键是要有无菌和卫生的概念，操作中注意避免污染。
2.4液氮罐的使用
配种员不注意液氮罐内外卫生，认为液氮可以杀灭细菌，不会造成污染。其实液N可以冷冻保存细菌，人们已证明液N罐内的细菌可能污染冷冻精液，尤其是颗粒冻精。因此，必须保持液N罐内外卫生，防止污染物进入罐内。取冻精时，罐塞应倒置，不要让插入罐口的部分接触尘土和污物，接触冻精和液N的器物应干净，液N至少每年清洗一次。
2.5输精枪（器）的使用
擦干细管或装输精枪时用手触摸细管端开口（这是一部分配种员最易犯的错误）和输精枪鞘头部。使用颗粒冻精时，有些配种员输完一头牛，仅用酒精棉球简单擦洗输精管的外部，又接着给下一头牛输精。
3.错误和不规则的操作
取冻精
取冻精时，精液提筒（袋）高出液N罐口，甚至提出罐口，冻精反复升温和降温，影响了剩余冻精的活力。
3.2解冻操作
有些配种员不用温度计，环境温度的变化会使手的感觉判断产生误差。使用的温度计也要注意是否准确。国内推荐的解冻温度是38℃～40℃，细管冻精国外近年推荐使用32℃～35℃解冻。（欧盟美国人工授精专家推荐解冻温度35℃±1℃）。
3.3镜检操作
有些配种员解冻后从不检查冻精活力，还有一些配种员用细管中1/4～1/3的精液检查活力，这两种做法都不正确。冷冻精液由不同的公牛和不同的种公牛站生产，经过长期保存和运输、分发和解冻等多个环节，很难保证质量万无一失。新用一头牛的冻精或新开一袋冻精应检查活力。一般检查时取很少一点样（输精前检查采样时，细管头部和输精器头端不能接触载玻片）或用输精后棉塞处剩余一点儿精液即可。取样多了则减少了输精的精子数，有经验的配种员没有必要每次和每只细管都检查。
3.4入输精器操作
入输精器时，先用手扳开阴唇，输精器外再加一个塑料保护套或塑料薄膜套（目前国内使用的输精塑料外鞘多是单根灭菌包装，可将塑料袋当阴道保护套用），以防止尿生殖前庭和阴道病菌的污染。用带塑料外鞘的细管枪输精，在塑料外鞘开袋时应从后端开口，不要从头端打开。有些是大包装，取用后要及时将袋口密闭。因此外鞘的头部要插入子宫，手触摸后或接触不清洁的空气会造成污染。
3.5输精器通过子宫颈操作
有些配种员主要靠持输精器的手来回戳的方法通过子宫颈，不注意发挥握子宫颈手的作用，操作用力过猛，动作粗暴，对子宫颈或子宫内膜造成损伤。输精时将输精器通过子宫颈是初学者的难点，操作时必须两手协同，主要靠伸入直肠内握子宫颈的手起作用，在输精器前行的同时，调整子宫颈的位置和角度，引导输精器通过。
3.6输精部位
由于国内前些年资料的介绍，单侧输精，两侧输精或三点输精的方法在国内影响较大。其实子宫体及子宫角腔内的裂隙很小，子宫体腔部分也很短（自然状态下多数仅1-2cm）；发情时充血的子宫内膜也很容易受伤出血；现在使用的细管输精枪外鞘头部开口较大，不光滑，在子宫腔内很容易损伤子宫内膜。
合理的输精部位是当输精器行至子宫颈内口处，输精器头端开口与子宫颈内口平行时，将精液输在子宫体基部。精液在子宫内会走向两侧子宫角，一个输精剂量的精子数可以保证正常受精。技术较好的配种员也可将精液输入卵泡侧子宫体浅部。手感不好或不知排卵侧时，盲目深部输精可能会将精液全部输入并排卵侧子宫角内，而导致排卵无精液。
4.发生问题的原因
4.1素质问题
相当一部分配种员没有机会接受严格正规的操作训练，专业素质不高，缺乏无菌概
念。错误的认为自己眼睛看见是干净的就符合无菌的标准，没有认识到病原菌和污染物存在的普遍性及危害，对自己的不卫生操作习惯习以为常。
4.2片面的经验
有些配种员根据自己的经验，认为操作粗一些没关系，对受胎率没影响。其实不是没影响，而是当时看不见任何外观变化。如果细菌污染轻微，母牛的抵抗力可以杀死或抑制细菌，则对本次输精受胎来造成影响。如果污染严重，则造成精子和卵子死亡或早期胚胎死亡，甚至引起子宫内膜炎。母牛机体的抵抗力和子宫的自洁能力有限，黄体期的安静子宫环境适合多种细菌的繁殖，子宫健康的母牛输精时将细菌带入子宫后，一个发情周期过后，母牛又返情了，甚至流出了炎性分泌物，变成难孕牛；有时初配青年母牛的配种由于不卫生操作，未受孕反而发生子宫内膜炎症。这些都是操作不卫生延误母牛受胎的例证。
4.3经费限制
冷配工作中卫生无菌做得不好，部分原因是由于基层工作经费不足，物质条件差所致。不过这不是主要的原因，冷配所需的物品有限，投入不大，而且投入可以几倍、十几倍地得到回报。要搞好冷配工作，必要的投入是值得的。
5.结语
配种员人工授精操作严格规范，养成良好的卫生和无菌操作的习惯，保证输入母牛子宫的都是遗传优秀，活力好，各项指标符合国家标准的精液，而没有给子宫内“接种”病原菌，这是冷冻精液人工授精十分关键的一环。但是仅这一方面还是不够的，还需要畜主、饲养员或配种员自己做好母牛的发情观察、鉴定及适时输精。配种员的责任心和吃苦精神是搞好工作的必不可少的。
科学合理的饲养管理是保证母牛正常的繁殖机能的基础，除了要考虑营养水平和营养成分的全价，注意补充维生素、矿物质、微量元素外，还要注意饲料中不含有毒有害物质。在日常管理中减少环境因素的影响，减少应激对母牛的影响。做好了这些工作，牛群应该可以达到正常的受胎率。
如果要使牛群达到90%以上的繁殖率，而且产犊间隔低于400d，配种指数低于1.7，还要做好如下工作：采取综合措施预防产科疾病，奶牛要及时彻底的治疗子宫内膜炎；黄牛要做好诱发发情；配种后的牛尽可能早的做好妊娠诊断，难孕牛及时治疗；妊娠牛做好保胎，防止胚胎死亡和早期流产。要做好这些工作对冷配技术员的专业知识，操作技能也提出了更高要求。
家畜冷冻精液名称及代号
黄牛类水牛类中国荷斯坦：HB摩拉水牛：ML西门塔尔：XM
安格斯：AG
用用短角：RD
婆罗门：PM尼里/拉菲水牛：NL中国水牛：CB三品杂水牛：NMC
篇二:《牛塑料细管冷冻精液技术》牛塑料细管冷冻精液技术
牛塑料细管冷冻精液
1范围
本标准规定了牛细管冻精液的质量标准、技术要求、检验规则。
本标准适用于乳、肉、兼用牛及黄牛的冷冻精液产品（以下简称“冻精”）。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
3引用标准
下列标准中牛细管冻精质量标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所示标准都会被修订，使用本标准的各方面应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB4143—84牛冷冻精液
GB5458液氮容器
4定义与术语
4.1精子：公畜生殖器官之产物，用于母畜受精。
4.2射精量：通过公畜交配所采到的精液毫升数。
4.3精液：按照适合于精子保存和使用的技术方法，经稀释和处理的精子。
4.4剂量：经过检定，单份包装，一次授精所需的精液量。
4.5批量：在一天之内以一头公牛的一次或多次射精所采集到的并用同一种方法对精液进行处理的若干剂量的精液。
4.6精子密度（SpermConcentration）：指每毫升精液中的精子数。
4.7精子活力（SpermActivityratepost-thaw）:指37℃下直线前进运动精子占总精子数的百分率。
4.8精子顶体完整率（Intactratespermarosinepost-thaw）：指顶体完整精子占总精子数的百分率。{微精子冷冻技术帮你解决}.
4.9精子崎型率（Abnormalspermratepost-thaw）：指崎型精子占总精子数的百分率。
4.10精子成活率（Spermsurvivalratepost-thaw）：指在37℃环境下保存4小时后直线前进运动精子占总精子数的百分率。
4.11细菌数（BacteriaCount）：指一剂量冻精经培养后出现的细菌菌落数。
5剂型：0.25ml塑料细管。
6牛细管冷冻精液质量标准
6.1剂量：细管冻精：0.2±0.03mL。执行GB4143——84所列条款执行。
6.2活力：一剂量细管冻精解冻后的精液活力占35%（即0.35）以上。
6.3有效精子数：一剂量细管冻精解冻后的精液直线前进运动的精子数≥1×10。执行GB4143——84所列条款执行。
6.4精子存活率：解冻后的细管精液37℃恒温箱中保存4小时检查活力，存活率≥1%（0.01）。
6.5精子顶体完整率≥40%。执行GB4143——84所列条款执行。
6.6精子畸形率≤20%。执行GB4143——84所列条款执行。
6.7细菌菌落数≤1000个，解冻后的精液中无病源性微生物。无GB4143—84规定之各种传染性疫病。
7检验规则及检查技术要点：
7.1检验规则
7.1.1每头公牛每批号的冻精必须有站质检人员检验合格才可准许发放，出售。
7.1.2出站前的每批冻精其外观、精子活力每头牛每批号的产品都必须检验。
7.1.3本标准技术要求中的全部项目，每头牛每月至少抽检一个批号产品。
6.1.4剂型检验应在每头牛每批号冻精产品中随即抽取，每个检验项目按三份检查。
7.1.5检样结果以抽检的三份样品的平均值为准。
7.1.6产品检验过程中任何一项技术要求不合格则判定为不合格产品。
7.2检查技术要点
7.2.1外观
7.2.1.1技术要点：细管无裂痕，两端封口严密，印制的标识应清晰。细管壁上必须注明生产单位、品种代码、公牛号、生产日期。
7.2.2活力
7.2.2.1技术要点；7
7.2.2.2解冻：细管冻精从液氮罐中迅速取出后投入到38℃—40℃水浴中快速摆动10—15秒钟，取出后借助手温搓动数下待检（输精时剪下封口端装枪）。
7.2.2.3检查：取解冻后精液50μl（微升）置于载玻片上，加盖玻片立即在200—400倍显微镜下观察活力。环境温度或载物台温度保持在34℃—38℃；也可通过电视显微装置在荧光屏观察活力。每个样品观察3个视野，注意观查不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。评定标准以百分制为主。（既35%的冻精活力可标记为0.35）
7.2.3有效精子数
7.2.3.1技术要点：检查方法：细管精液用血色素管准确吸取20微升解冻精液，注入盛有0.98ml的3.0%氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为100倍稀释的稀释精液。将准备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用小细管吸取一滴稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满，不能有气泡或厚度过大，然后在显微镜或电视荧光屏上观察计数。
7.2.3.2计算公式：
A每剂量中精子数=5个中方格精子数×250×剂量数。
B每样品观察上下两个计数室，取平均值。如两个计数室计数结果误差超过5%，则应重检。
C每剂量中直线前进运动精子数=每剂量精子数×活力（%）
7.2.4精子存活率
7.2.4.1技术要点:
7.2.4.2解冻方法按照2.1.1技术要点操作。
7.2.4.3精子活力的检查按照2.1.2技术要点操作。
7.2.5精子顶体完整率{微精子冷冻技术帮你解决}.
7.2.5.1技术要点：
7.2.5.2试剂配置：
A.磷酸盐缓冲液：
鳞酸二氢钠（NaH2PO4.2H20）0.05g
鳞酸氢二钠（Na2HPO4.12H20）2.25g
SHUAN双蒸水定溶至100ml
B中性福尔马林固定液:
40%甲醛HCHO(使用前经碳酸镁中和过滤)8.0ml
鳞酸二氢钠（NaH2PO4.2H20）0.05g
鳞酸氢二钠（Na2HPO4.12H20）2.25g
用0.89%氯化钠溶液约50.0ml溶解后,加入8.0ml中和后的甲醛,再加0.89%氯化钠溶液定溶至100.0ml。
C姬姆萨原液：
姬姆萨染液1.0g
甘油C3H5（OH）366.0ml
甲醇CH3（OH）66.0ml
姬姆萨染液放入研体中加入少量甘油充分研磨至无颗粒为止,然后将甘油全部倒入并放入恒温箱中保温能够继续溶解4小时,再加甲醇充分溶解混匀,过滤后储存于棕色瓶中待用,储存时间越久染色效果越好.
D.姬姆萨染液:(现配现用)
姬姆萨原液2.0ml
磷酸盐缓冲液3.0ml
蒸馏水5.0ml
7.2.5.3制片染色:
A.抹片:
取解冻后精液一滴滴于载玻片一端,用另一边缘光滑载玻片于有样品载玻片呈35℃夹角,将样品均匀地涂抹于载玻片上,自然风干(约5分钟)。但要注意在制片时，载玻片温度应保持37℃-38℃制片效果比较好。
B.固定:
在已风干的抹片上滴上1-2ml中性福尔马林,固定15分钟后用清水缓缓冲去固定液,吹干或自然风干。
C.染片:
将固定好的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上,把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间,让其充满平槽并使抹片接触染液,染色1.5小时后用清水缓缓冲去染液,晾干待检。
D.镜检：
将制备好的抹片置于显微镜（1000倍油镜）下观察。
E.每个样品制作两个抹片，每个抹片观察200个以上的精子（分左、右两个区），取两片的平均值，两片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制片。
F.精子顶体完整率计算：
精子顶体完整率（%）=顶体完整精子数/精子总数×100
7.2.6精子畸形率
7.2.6.1技术要点：
7.2.6.2制片染色按照5.1.2操作
7.2.6.3畸形精子率的计算：
畸形精子率（%）=畸形精子/精子总数×100
7.2.7细菌菌落数
7.2.7.1技术要点：