Cystatin C在诊断肾功能损害中的应用及其新进展(一)
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【关键词】 胱蛋白酶抑制剂C；肾功能损害；诊断
1肾功能损害的常用测定指标
肾小球的主要功能是滤过作用，临床上常用的测定肾小球滤过功能的指标有血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、内生肌酐清除率(r)、血β2微球蛋白(β2M)和视黄醇结合蛋白(RBP). 这些指标虽然在临床上广泛应用，但它们仍有一定的局限性，且常受一些肾性和肾外因素的影响，如BUN在肾小球功能轻度受损时可无变化，且受蛋白质摄入量和体内蛋白质分解代谢的影响；Scr也不能作为肾脏损害的早期指标，其水平受肌肉量，肉食的摄入量和体内代谢水平的影响；r是反映肾小球滤过功能的敏感指标，当r下降到80%以下时，Scr和BUN可正常，但肾小管分泌少量肌酐，会使测定结果偏高，在病理状态下其生成速度也会增快，使测定结果不准确. 近年来，同位素标记物清除率的测定方法已被广泛使用，但由于放射缘故，使其临床应用受限. 国外报道较多的有非粒子造影剂iohexol（碘海醇）血浆清除率测定，其准确性和同位素相当，是目前较理想的方法，但以上方法需要留取尿液，并且价格昂贵，需要一定的仪器设备，难以作为常规测定指标.
2一种新的肾功能测定指标胱蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)
Cystatin C是一种非糖基化的碱性蛋白质，主要分布于细胞外液中，脑脊液中浓度最高，尿中的浓度最低. 它含有120个氨基酸，相对分子质量Mr=13 359，人体所有的有核细胞都可以持续的产生Cystatin C. 其产量不受其他因素（如年龄、性别、饮食、炎症等）的影响. 肾脏是Cystatin C的主要分解代谢器官，低分子量和高等电点（PI=9.3）使其能自由的通过肾小球基底膜，而且在近端肾小管几乎全部被重吸收和分解代谢.
Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一种，在肽链C端有两个二硫键. Cystatin C基因属看家基因，它在人体组织中能被稳定的表达. Cystatin C的一些基因型和其基因的多态性与某些肿瘤的发生有关. 因此，Cystatin C不仅可以作为判断肾小球滤过率(GFR)的分子指标，也可以作为癌症患者潜在的GFR的分子指标，并且不受化疗的影响.
3Cystatin C与其他指标的比较
Crubb〔1〕将51crEDTA测定的GFR与血清Cystatin C和Scr相比较，其相关系数r分别为0.77和0.75. Bokenkamp等〔2〕将菊粉测定的GFR与血清Cystatin C和Scr比较，相关系数r分别是0.88和0.72；用碘海醇法测定的GFR与血清Cystatin C和Scr比较，相关系数r分别是0.87和0.71. 以上研究表明，Cystatin C与GFR比Scr与GFR有更好的相关性. 李玉林等〔3〕用乳胶增强的免疫散射法测Cystatin C，还分别测了Scr和r，并比较了它们之间的相关性，结果发现血清Cystatin C与Scr有显著正线性相关（P0.001），与r的对数值呈显著负线性相关：Log Cystatin C=-0.606Log r+1.209(r=-0.887)；沈清等〔4〕用ELISA法测Cystatin C，并分析各指标之间的相关性发现，血清Cystatin C与r呈显著负相关（r=-0.774），血清Cystatin C与Scr呈显著正相关（r=0.709），Scr与r呈显著负相关（r=-0.674），血清Cystatin C与r的相关性高于Scr与r的相关性.
4Cystatin C 诊断肾功能损害的敏感性和特异性
Risch等〔5〕对30例曾行肾移植现处于稳定状态者（男女各半）检测其血清Cystatin C，Scr，r和B2微球蛋白，发现Cystatin C和GFR的相关性最好（r=0.83），Scr(r=0.67), r(r=0.57)和β2微球蛋白(r=0.58),均不如Cystatin C； Erlandsen等〔6〕采用粒子增强比浊免疫法测47例非胰岛素依赖型糖尿病患者的Cystatin C，Scr和r，相关曲线(ROC)分析表明，Cystatin C诊断的灵敏度明显高于Scr和r. Cystatin C最好的诊断率（98%）时其截断点应设在1.32 mg/L；Jong等〔7〕对癌症化疗患者进行早期肾损伤检测，发现Cystatin C和r有很大的相关性， Cystatin C比r更敏感（r=0.84，P=0.01），如果以1.33 mg/L的Cystatin C为截断点，检测小于78 mL/min Cystatin C的r时，Cystatin C的灵敏度为87%，特异性为100%，回归分析表明，检测Cystatin C比r更好.
沈清等〔4〕用ELISA法分析185例不同程度的肾病患者（按r值分组）发现，r小于80 mL/min的患者中，93%的患者Cystatin C高于正常，而84%的患者Scr高于正常，r在50~79 mL/min之间的患者组中，77%的Cystatin C高于正常，58%的Scr高于正常，r在25~49 mL/min之间的患者中，有100%的患者Cystatin C高于正常，而只有87%的患者Scr高于正常，在r高于80 mL/min的患者中，有95%的Cystatin C在正常范围内，有100%的患者Scr在正常范围. 由此发现，Cystatin C对肾功能损害，尤其是早期肾损的患者，比Scr更敏感. 李玉林〔3〕分析不同年龄不同性别的患者发现，Cystatin C在男性组和女性组不同年龄间无显著差异（P>0.05），对r异常的患者，Cystatin C比Scr有更显著的符合率. 由此可见，Cystatin C在诊断肾功能损害上有以下特点：①有稳定的生成速度，不受年龄、性别和其他病理状态的影响；②能自由地被肾小球滤过；③不被肾小管重吸收和分泌.
5Cystatin C的测定方法
自从Price等〔8〕在脑脊液中发现Cystatin C后，许多学者致力于寻找一种更快速、更准确的Cystatin C测定方法. 1979年Grubb等〔1〕提出了酶放大免疫扩散法，这种方法比较繁琐，不适用大批量测定. 随后，随着各种免疫方法的不断完善，1993年Coll等〔9〕提出了酶联免疫吸附法（ELISA），ELISA 法是一种定量检测Cystatin C的方法，它以包被固相载体的兔特异性多克隆抗体为第一抗体，加入待测血清后，再加入辣根过氧化物酶标记的鼠抗人Cystatin C的第二抗体，孵育后加入发光基质底物，450 nm处显色. 该方法大大提高了Cystatin C检测的灵敏度，其最低可测限为0.02 nmol/L，分析时间需要4.5 h. 1995年Bowers等〔10〕提出的粒子增强比浊法使Cystatin C测定更上了一个台阶，其分析时间缩短到10 min，在浓度为1.5 mg/L时，其精确度为批内平均CV=2.6%，批间平均CV=6.6%，在浓度为5.8 mg/L时，批内平均CV=0.9%，批间平均CV=3.2%. 最近，德灵公司又提出了乳胶增强的散射免疫比浊法测Cystatin C，它是以多克隆兔抗体为基础的改良免疫比浊分析法，它以人尿中纯的Cystatin C定标，血清和肝素抗凝血浆均可用，整个分析过程只需要6 min，测定范围为0.87~4.63 mg/L，在浓度为0.25~7.90 mg/L范围内，批内CV1.8%，批间CV1.8%. 在整个测定范围内，理论值与实际值有良好的相关性.
6Cystatin C的临床应用新进展
6.1Cystatin C在淀粉样蛋白沉积性血管病(HAA)病因学研究中的应用遗传性Cystatin C HAA是一种常染色体显性遗传病，由于脑动脉内淀粉状蛋白纤维沉积，引起颅内反复出血，导致中风、精神错乱、甚至死亡. HAA的发病机制至今还不是十分清楚.最近有研究发现，HAA的发病与Cystatin C的基因突变紧密相关. Asgeirsson等〔11〕测定HAA患者脑脊液中Cystatin C水平并与健康人对照发现，HAA患者脑脊液中Cystatin C浓度仅为健康人的1/3，从HAA患者中分离出单核细胞进行体外培养发现，HAA患者单核细胞分泌Cystatin C的能力远远低于健康对照，但其细胞内Cystatin C mRNA的转录活性并没有受限，初步估计HAA是由于Cystatin C突变株分泌减少，甚至不分泌，从而在细胞内积聚，形成淀粉状纤维丝. 通过对Cystatin C突变株基因型分析发现，Cystatin C的基因突变发生在第68个氨基酸上，由谷氨酸取代了原来的亮氨酸. 进一步研究发现，Cystatin C突变株不仅由Leu变为Gln，且其N端有10个氨基酸被截断，这可能是脑动脉内淀粉状纤维丝沉积的又一个因素，还需要进一步研究.