高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡(一)

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【摘要】 目的： 构建人c?Jun氨基末端激酶3（JNK3）真核表达载体，转染HEK293细胞，建立稳定表达细胞系；以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡关系. 方法： 以pDBLeu?JNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长，DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1/myc?His B，经PCR和酶切鉴定，DNA测序正确，脂质体转染法转染HEK293细胞，通过G418选择培养，建立稳定表达细胞系. RT?PCR，Western Blot检测携带Myc标签的JNK3融合蛋白的表达，流式检测表阿霉素对稳定表达JNK3基因的HEK293细胞的促凋亡作用. 结果： 成功构建了pcDNA3.1?JNK3真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞，建立了稳定表达细胞系，成功地表达目的基因；与对照细胞相比表阿霉素能明显促进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡. 结论： JNK3稳定表达细胞系的建立和高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡，为进一步研究JNK3的功能提供了良好的实验基础.

【关键词】 C?Jum氨基末端激酶 真核表达载体 转染 因表 细胞凋亡

　　0引言

　　c?Jun氨基末端激酶(c?Jun N?terminal kinases，JNKs)为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)超家族之一. 在脊椎动物，JNK由jnk1，jnk2，jnk3三种基因编码，表达的JNK1，JNK2，JNK3蛋白主要位于细胞质，为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶. JNK3与JNK1，JNK2的不同在于：JNK3有一个与位于JNK1，JNK2的N末端保守的甲硫氨酸残基融合在一起的延长的N末端区域〔1〕；JNK1，JNK2在组织内广泛表达，JNK3在脑、心脏、睾丸等组织特异表达. 近年来研究发现JNK3参与神经细胞凋亡的调控，可促进缺血、缺氧和有毒化学物质导致的神经细胞的凋亡. 目前对JNK3促细胞凋亡机制还不是很清楚. 我们通过构建稳定转染JNK3基因的细胞系，以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡的关系，为研究JNK3促进细胞凋亡机制提供细胞模型.

　　1材料和方法

　　1.1材料菌株E.coli JM109，质粒pDBLeu?JNK3，pcDNA3.1/myc?His B和HEK293细胞由本实验室保存. DMEM，G418（Gibco公司）；胎牛血清（Life Technologies公司）；PCR及酶切产物纯化试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、反转录试剂盒（Promega公司）；DNA Marker，DNA限制性内切酶(EcoRⅤ，XhoⅠ)、pyrobest DNA polymerase，rTaq酶（TaKaRa公司）；T4 DNA连接酶（New England Biolab公司）；Trizol、转染试剂脂质体lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；AnnexinⅤ?FITC 试剂盒（晶美生物工程有限公司）；Myc抗体、actin抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG和ECL检测试剂（Santa Cruz公司）；其余试剂均为国产分析纯.

　　1.2方法

　　1.2.1引物设计与合成根据GenBank登录的人JNK3基因的序列(序列号为NM_002753)设计引物, 上游引物为：5＇?ggatatcATGAGTATTTCTTAT?3＇，下游引物为：5＇?gctcgagCGCTGCTGCATGTGCTG?3＇，分别在上游引物和下游引物的5＇端加入EcoRV，XhoI的酶切位点和3个保护碱基，引物由赛百盛公司合成.

　　1.2.2人JNK3基因全长的获取以pDBLeu?JNK3质粒为模板，采用PCR扩增人JNK3基因，全长1269 bp. PCR 50 μL反应体系中加pDBLeu?JNK3质粒模板1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL, 10 μmol/L JNK3上下游引物各2 μL，pyrobest DNA polymerase 0.25 μL，加无菌水至50 μL. 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 80 s，35个循环；72℃ 10 min. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定并胶回收纯化.

　　1.2.3人JNK3真核表达载体的构建将上述PCR产物和pcDNA3.1/myc?His B质粒分别用限制性内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ酶切后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4 DNA连接酶连接后转化E.coli JM109感受态，铺在含氨苄青霉素的LB平板上筛选，选取阳性克隆进行菌落PCR和酶切鉴定，阳性克隆经测序分析后证实并命名为pcDNA3.1?JNK3.

　　1.2.4建立稳定表达人JNK3的HEK293细胞系HEK293细胞在含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基中，于37℃，50 mL/L CO2 的饱和湿度下培养. 待细胞融合至70％～80％时按照Lipofectamine 2000操作说明书进行重组质粒pcDNA3.1?JNK3和空质粒pcDNA3.1/myc?His B的转染. 转染48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺在直径为10 cm的细胞培养皿中，待细胞贴壁后，换含有G418(1400 mg/L)的选择性培养基加压培养2 wk，每3 d换液清除死亡细胞，待细胞培养皿中长出肉眼可见的单克隆时挑选单克隆并依次转移至96孔板、24孔板、6孔板、培养瓶内扩大培养. 筛选出的稳定表达人JNK3和Myc标签的HEK293细胞系，分别命名为HEK293?JNK3细胞和HEK293?mock细胞.

　　1.2.5RT?PCR检测JNK3的表达收集HEK293?JNK3细胞和HEK293?mock细胞，按Trizol试剂说明书抽提细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书进行反转录. 取1 μg定量后的RNA，加水补至10 μL，70℃ 10 min，加10×反应缓冲液2 μL，MgCl2 4 μL，dNTP 2 μL，OligodT 1 μL，rRNasin 0.5 μL，AMV（15 U）0.75 μL. 反应体系共20 μL；42℃ 1 h；95℃ 5 min；4℃ 5 min. 以 GAPDH（900 bp）为内参进行PCR反应. 在25 μL PCR反应体系中加入cDNA模板1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L JNK3和GAPDH上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.15 μL，加水补足至25 μL，反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s, 72℃ 80 s，30个循环；72℃ 10 min. 取等体积RT?PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析.

　　1.2.6Western Blot 检测JNK3蛋白的表达收集筛选细胞，用含蛋白酶抑制剂的单去污细胞裂解液裂解细胞，4℃，12 000 g，离心10 min，收集上清. 对收集的蛋白样品进行定量，取20 μg处理后的蛋白样品进行SDS?PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，50 g/L 脱脂奶粉室温振荡封闭2 h，与1∶2000稀释后的Myc一抗4℃ 孵育过夜，TBST洗膜3次. 然后与1∶5000稀释后的HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL显色系统检测目的蛋白，显影.

　　1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡对数生长期的HEK293?JNK3细胞和HEK293?mock细胞，调整细胞计数为2×108/L，接种于50 mL 细胞培养瓶中，常规培养24 h后，同时加入终浓度为0.2，0.5，1.0 mg/L的表阿霉素，空白对照组加入等量DMEM，继续培养48 h后收集细胞，进行Annexin V/PI标记：将细胞悬浮于250 μL 结合缓冲液中，调细胞数为1×109 /L, 加Annexin V/FITC 5 μL， 20 mg/L碘化丙锭溶液10 μL，混匀，室温避光孵育15 min，用适量稀释缓冲液稀释，流式细胞仪检测.