沙鼠短暂性脑缺血及西比灵干预后脑内Smad2和Smad4表达的研究(一)

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【摘要】 目的 研究沙鼠短暂性脑缺血及西比灵干预后脑内Smad2和Smad4蛋白的表达。方法 制作沙鼠脑缺血再灌注模型，用免疫组化法检测脑内Smad2、Smad4蛋白的表达变化。结果 各组沙鼠神经元和胶质细胞胞浆内均有Smad2、Smad4蛋白阳性表达，且Smad4蛋白表达均显著强于Smad2蛋白。缺血再灌注6h、1天后Smad2、Smad4蛋白表达显著上调(P0.05)。同脑缺血组相比，西比灵干预组20只沙鼠神经元和神经胶质细胞内Smad2和Smad4蛋白在缺血再灌注6h、1天时表达明显下调(P0.05)。结论 沙鼠脑神经细胞和神经胶质细胞内均有Smad2、Smad4蛋白表达；西比灵干预后，缺血再灌注沙鼠脑神经细胞和神经胶质细胞内Smad2和Smad4蛋白表达下调。提示Smad2和Smad4蛋白可能是缺血性脑损伤程度的又一重要标志；Smad4、Smad2在沙鼠脑缺血的发生和发展过程中可能有协同作用。

【关键词】 Smad蛋白；免疫组化；缺血再灌注；沙鼠

【Abstract】 Objective To study the expressions of Smad2 and Smad4 protein of flunarizine on the expressions of tissue following cerebral ischemic reperfusion in gerbil.Methods A cerebral ischemia - reperfusion model in gerbils was established . The expressions of Smad2 and Smad4 protein in brain tissue were detected by using immunohistochemistry technique at the 6th hour, 1st day after ischemic reperfusion (IR).Results Experimental results revealed that Smad2 and Smad4 protein were expressed in neurons and gliacytes of brain tissue in all gerbils, and expression of Smad4 protein is higher than that of Smad2 protein(P0.05). pared with normal control group, the expression of Smad2 and Smad4 protein in neurons and gliacytes of ischemic gerbils was evidently increased at the 6th hour, 1 day (P 0.05).pared with cerebral ischemia group, the expression of Smad2 and Smad4 protein in neurons and gliacytes of gerbils in flunarizine treatment group was evidently decreased at the 6th hour,1st day(P0.05).Conclusion Smad2 and Smad4 protein were expressed in neurons and gliacytes of brain tissue in gerbils; and the expression of Smad2 and Smad4 protein in neurons and gliacytes of gerbils in flunarizine treatment group were evidently decreased.Smad2 and Smad4 protein might be important factors of mark of brain injury following cerebral ischemic reperfusion.Smad2 and Smad4 protein may take on synergistic actions in normal brain tissue of gerbils and in the ourrence and development of signal transduction of cerebral ischemia gerbil.

【Key words】 Smad；protein；immunohistochemistry；ischemia-reperfusion;gerbil

体内外实验均证明，转化生长因子β有神经保护作用〔1〕。脑缺血后，脑组织内TGF-β表达增高，是机体对缺血性脑损伤的一种保护性反应〔2〕。TGF-β1增高能减少脑梗死面积，抵御脑缺血性损伤。Smad蛋白是辅助TGF-β超家族信号在细胞内传导的一族蛋白，包括了Smad2、Smad4等〔3〕；直接参与TGF-β超家族成员的信号传导，是TGF-β超家族成员参与生命活动的重要介质。我们通过免疫组化技术测定沙鼠正常脑组织；缺血再灌注后脑组织及西比灵干预后缺血再灌注后脑组织及Smad2/4转录水平的表达,初步发现了Smad2、Smad4之间的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性蒙古沙鼠60只，9月龄，体重（90±5）g，购自上海实验动物管理委员会。随机分为正常组、假手术组、脑缺血组及西比灵干预组。

1.1.2 主要试剂 Smad2、Smad4免疫组化检测试剂盒，一抗(鼠IgG)，二抗(羊抗鼠IgG)，抗原修复液I，山羊血清封闭液、SABC等和DAB显色试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供；西比灵胶囊由西安杨森医药公司提供。

1.1.3 主要仪器 石蜡切片机、免疫组化专用盖玻片(武汉博士德生物工程有限公司提供)、恒温箱、冰箱、显微镜、照相机等。

1.2 实验步骤和方法

1.2.1 动物模型的建立 健康雄性蒙古沙鼠，用3%戊巴比妥以30mg/kg的剂量腹腔注射进行麻醉，固定动物，消毒，颈正中切开皮肤1.5cm左右，钝性分离皮下组织，分离双侧颈总动脉，微血管夹夹闭双侧颈总动脉10min后松夹再灌注，缝合皮肤。

1.2.2 动物的分组和处置 正常组10只，不予任何处理即断头处死动物。假手术组10只，仅分离双侧的颈总动脉，不予夹闭，就缝合皮肤，1天后断头处死。脑缺血组：共20只沙鼠，分为缺血6h组（IR6h）、缺血1天组（IRld）两组，每组10只，分别在缺血再灌注(IR)6h、1天时间点处死动物。西比灵干预组共20只沙鼠，分为IR6h,IRld两组，每组n=10，在缺血再灌注前一天给予喂食西比灵〔按20mg/(kg・d)〕。分别在缺血再灌注(IR)6h、1天时间点处死动物。所有实验动物在预定时间断头处死，快速取前脑置10%福尔马林固定,常规石蜡包埋后5μm连续切片。

1.2.3 SMAD蛋白表达的检测 免疫组化:按常规SABC法进行，一抗的稀释度均为1：100。

1.2.4 结果判定 病理结果采用相邻脑组织切片作常规HE染色，用光镜观察其组织病理变化，估计脑损伤程度。免疫组化取各组沙鼠断面水平相似的连续组织切片，所有切片分析均在同一强度、同一放大倍数下进行，每个指标采用阳性细胞计数法。在40×10倍的光镜视野下观察免疫反应，以细胞浆着棕褐色为阳性，每张切片在高倍视野下分别取上、下、左、右及中心共5个区域进行细胞计数, 每个区计数200个细胞, 共计数1000个细胞, 计算染色细胞所占比例，即为Smad2、Smad4表达指数。

1.3 统计学分析 各组检测结果用单因素方差分析方法，2个独立样本用t检验，两变量间相关关系用直线相关分析，计算Pearson相关系数;确定P0.05差异有显著性；所有统计分析均用SPSS11.0统计软件包完成。