胡桃醌对人肝癌BEL?7402细胞增殖和膜流动性的影响(一)

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作者：陈丽 那顺巴雅尔 张建 于娟 顾为望

【摘要】 目的：研究胡桃醌诱导人肝癌BEL?7402细胞凋亡及其作用机制。方法：采用MTT法测定细胞生长抑制率，通过流式细胞仪观察凋亡细胞，采用荧光偏振技术离体动态地检测30 min内胡桃醌对BEL?7402细胞各向异性r、荧光偏振度P和微粘度η的影响，分析细胞膜流动性的改变。结果：各浓度的胡桃醌均可抑制人肝癌BEL?7402细胞的生长，诱导其凋亡，IC50为13.78μM。不同浓度胡桃醌均可引起BEL?7402细胞膜的r、P和η值显著性降低（P0.05），尤其在前1 min内r、P、η值下降迅速，1min后各指标下降的趋势渐渐平缓。结论：胡桃醌能显著增加BEL?7402细胞的膜流动性，促进其本身进入细胞内部，抑制细胞的增殖，诱导细胞凋亡。

【关键词】 胡桃醌； BEL?7402； 细胞凋亡； 膜流动性

胡桃醌（Juglone），又名5?羟基?1，4?萘醌，分子式C10H6O3。存在于胡桃科植物胡桃及其同属植物黑核桃的未成熟的外果皮(青皮)、树枝和树皮中，是其主要的毒性物质 〔1，2〕。胡桃醌为棕红色结晶，其熔点155℃，微溶于水，遇碱呈紫红色,有升华性，其化学结构清楚（图1）。国外曾有研究者对胡桃醌的抗肿瘤活性做过部分研究，但未见用于临床〔3～5〕。民间胡桃皮作为抗癌验方，渊源流长，作为胡桃青皮的主要成分胡桃醌的抗癌活性国内亦有报道。研究表明胡桃醌还有抗真菌、抗衣原体或HIV病毒、降血糖和杀虫等生物活性，越来越受到人们的重视〔6～9〕。胡桃醌可以直接抑制体外培养肿瘤细胞的增殖，其作用与药物浓度和作用时间有依赖关系，有希望成为新的化疗药物。但目前关于胡桃醌诱导肿瘤细胞凋亡的细胞信号调控机制尚不明确,已有报道的结论不甚一致。另外，由于细胞膜不仅与细胞的生长调控过程、免疫反应和信息传递等基本功能密切相关，而细胞表面成分的改变又与肿瘤细胞的侵袭、转移能力密切相关因此，本研究采用人肝癌BEL?7402细胞系为模型，在考察胡桃醌对BEL?7402细胞增殖影响的基础上，在诱导细胞分化的过程中观察胡桃醌对肿瘤细胞膜的影响，探讨其抗肿瘤作用的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

胡桃醌：购自sigma，Lot：07605DH。精密称取3.5mg胡桃醌，溶于100μLDMSO中，再用PBS稀释成终浓度为20mM的胡桃醌母液，-20℃保存备用。新生牛血清（FBS）：购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，Lot：TBD41HX。使用前置于56℃水浴中灭活30min，-20℃保存备用。青霉素/链霉素液：购自TBD，Lot：20080318。RPMI 1640培养基：购自海克隆生物化学制品有限公司，Lot：NSG0058，使用前每500ml培养基分别加入10%的FBS，5.5ml青霉素/链霉素液，配制成完全培养基，4℃保存。胰蛋白酶/EDTA消化液：购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，Lot：TE2004Y。二甲基亚砜（DMSO）：购自sigma，Lot：D5879，常温避光保存。1，6?二苯基?1，3，5?己三烯(DPH)购自sigma公司，Lot：076K3674。Flou?3/AM购自Biotium，InC，Lot：6F0221。其余试剂为国产分析纯。MTT：购自Sigma，Lot：M2128，用PBS配成5mg/ml工作液，44℃避光保存。

YG?875B超净工作台，上海医疗器械厂。CO2细胞培养箱为Thermo公司，多光谱微孔板阅读器Version 5为美国Mecular Devices Corporation公司，FACSCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司。

1.2 细胞培养与处理

BEL?7402细胞，广东药学院寄生虫教研室惠赠。细胞置于RPMI 1640完全培养基中，在37℃、体积分数为5% CO2，95％湿度培养箱中培养。细胞单层贴壁生长，每3天更换1次培养基，细胞每周按1：3传代。

1.3 胡桃醌对BEL?7402细胞株生长的影响

取对数生长期的BEL?7402细胞株，用含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度为1×105/mL细胞，体积为 200μL，铺96孔培养板，复孔8孔，体外培养24h 后更换为含系列浓度的胡桃醌培养液（终浓度分别为100、50、25、12.5及6.25μM），设立正常对照组和溶剂对照组（1‰DMSO），体外培养48 h后以 MTT法测定OD值，实验重复3次，依下列公式计算胡桃醌对BEL?7402细胞株的抑制率：

抑制率(%) =（1-试验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率

取BEL?7402细胞悬液，调整细胞数至1×106/mL ，1000 rpm，离心5min，PBS洗2遍，70%乙醇4℃固定24 h，去除乙醇固定液，PBS清洗，加碘化丙啶(propidiumlodide，PI)染液(含PI 20μg/mL，RnaseA 0.25 mg/mL)0.5mL）。4℃避光染色30 min以上，400目网过滤后上流式细胞仪检测〔10〕。

1.5 胡桃醌对BEL?7402膜流动性的影响

1.5.1 DPH荧光探剂负载液的配制 将0.464 mgDPH溶于1 mL四氢呋喃中，得到浓度为2 mM的储备液，避光保存于-20℃冰箱。用前在室温下融化，添加Hanks液稀释成终浓度为2μM的DPH荧光探剂负载液。

1.5.2 DPI荧光探剂的负载 待BEL?7402细胞生长至80％融合后，用0.25%胰蛋白酶溶液消化1～2 min，待细胞质回缩、胞体趋于变圆、细胞间缝隙增大时，然后加入完全培养基终止消化并收集细胞，调整细胞数为2×107/mL，离心(1000rpm，10 min)，去上清，沉淀细胞加入1.5 mL的DPH负载液，吹打成细胞悬液，避光37℃孵育30min，2000rpm离心5min，弃去上清，沉淀重悬于Hanks液中待测。

1.5.3 荧光偏振法检测膜流动性 实验分为空白对照组、溶剂对照组和不同浓度胡桃醌给药组。待多光谱微孔阅读器稳定后，分别加入反应终浓度为400、200、100、50、25、12.5、6.25μM 的胡桃醌，空白对照组加入同体积Hanks液，溶剂对照组加入同体积2‰DMSO。用多光谱微孔板阅读器测定荧光强度，测定条件：激发波长362nm，发射波长432nm，激发狭缝10nm，发射狭缝10nm，温度25±0.5 ℃。BEL?7402细胞膜流动性用各向异性r、荧光偏振度P和微粘度η表示。r、P、η越小，膜流动性越大，反之，膜流动性越小。计算公式如下(G为仪器检测偏振时的校正因子)：

G=IHVIHH P=IVV-GIVHIVV-GIMVH η=2P0.46-P

其中I为起偏器和检偏器光轴均在垂直方向时的荧光强度；IHV为起偏器光轴在垂直方向检偏器光轴在水平方向时的荧光强度；IHH为起偏器光轴和检偏器光轴均在水平方向的荧光强度；IVH为起偏器光轴在水平方向检偏器光轴在垂直方向时的荧光强度。