民族药响铃草的体外抑菌活性研究(一)

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作者：周英 王慧娟 段震 李燕 黄赤夫

【摘要】 　　目的探讨响铃草的体外抑菌作用。方法采用打孔琼脂扩散法和稀释法对响铃草不同溶剂提取物进行抑菌实验研究。结果响铃草的不同溶剂提取物对供试细菌和真菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌以及黄霉菌）均有一定程度的抑制作用。结论响铃草提取物有明显的体外抑菌作用。

【关键词】 响铃草； 抑菌； 最小抑菌浓度； 抑菌圈

　　Abstract：ObjectiveTo study the antibacterial activities of different solvent extracts of Crotalaria ferruginea Grah.MethodsBy the agar diffusion and dilution method,minimal inhibitory concentration(MIC) and inhibitory circle of the extract were determined.ResultsThe antibacterial activity of the extracts was different to different microbes.ConclusionCrotalaria ferruginea Grah has good antibacterial activity in vitro.

　　Key words：Crotalaria ferruginea Grah; Antibacterial; MIC； Inhibitory circle

　　响铃草为豆科狗屎豆属植物假地蓝Crotalaria ferruginea Grah的全草或带根全草〔1〕。响铃草为多年生草本，花期6～10月，生于山坡、荒地〔2〕。在贵州、云南较为常见，为贵州侗族常用药之一〔3〕。响铃草味苦、微酸、性寒，在贵州民间用于久咳痰血、耳鸣耳聋、头晕目眩、慢性肾炎、扁桃体炎、淋巴腺炎、疔毒恶疮以及月经不调等〔4〕。

　　目前文献中尚无响铃草的抑菌作用报道，本实验首次对其不同溶剂提取物对常见致病革兰氏阳性、革兰氏阴性菌以及黄霉菌的抑制活性进行了研究，为阐明其抗菌特性以及响铃草的进一步开发利用和寻找新的抗菌药物提供基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与仪器

　　1.1.1 材料响铃草购于贵州省药材公司，产地：四川，包装批号060702 。

　　1.1.2 试剂石油醚，醋酸乙酯，甲醇，乙醇，95%乙醇，二甲基甲酰胺均为分析纯，购于贵阳中兴化学试剂公司。

　　1.1.3 菌种购自中国微生物菌种保藏中心，金黄色葡萄球菌Staphylocous aureus；大肠杆菌Escherichia coli；粪链球菌Enterocous faecalis；黄霉菌Aspergillus flavus；绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa；藤黄微球菌Microcous luteus。

　　1.1.4 培养基MRS固体培养基：酪蛋白胨10 g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，乙酸钠5 g，柠檬酸二铵2.0 g，Tween 80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，MnSO4・H2O 0.2 g，MgSO4・7H2O 0.05 g，CaCO3 20.0 g，琼脂15 g， 定容至1 000 ml，pH值 调至6.8；营养肉汤固体培养基： 蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，定容至1 000 ml，pH值 调至7.0；查氏固体培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1.0 g，MgSO4・7H2O 0.05 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，液体培养基组成除了不加琼脂外，与相应的固体培养基相同。

　　1.1.5 仪器高低温恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），旋转蒸发仪（BUCHI R-200），SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），电子天平（OHAUS）净化工作台（上海市纯昱科学仪器有限公司），真空冷冻干燥机（LABCONCO），超低温冰箱（Forma Scientific），双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司TU-1901）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 响铃草不同溶剂提取物的制备方法将干燥的响铃草粉碎过40目筛，称取等量的响铃草3份，每份150 g，分别置于1 000 ml的水、酒精、醋酸乙酯中。每种溶剂浸泡3次，每次置于恒温（37℃）摇床上（200 r/min）振荡12 h，抽滤得到提取液。水的提取液于-80℃冷冻过夜后用真空冷冻干燥机干燥；酒精提取液40℃减压旋转浓缩除去酒精，于-80℃冷冻过夜后用真空冷冻干燥机干燥；醋酸乙酯提取液先减压浓缩除去醋酸乙酯，得浸膏。

　　1.2.2 对响铃草不同溶剂提取物的抑菌活性检测

　　菌种培养：金黄色葡萄球菌staphylocous aureus，大肠杆菌Escherichia coli，绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa，藤黄微球菌Microcous luteus采用营养肉汤培养基（组成成分见上）活化培养，粪链球菌Enterocous faecalis采用MRS培养基（组成成分见上）活化培养，黄霉菌Aspergillus flavus采用查氏培养基（组成成分见上）活化培养，分别将各菌种浓度调至OD600约为1，待用。

　　采用试管稀释法对最低抑菌浓度（MIC）的测定：取上述得到的水和酒精溶剂的粗提物0.1 g，溶于 1 ml无菌水中，醋酸乙酯溶剂的提取物0.1 g溶于1 ml DMF，使其充分溶解，用细菌过滤器过滤，取0.3 ml样品溶液以相应的液体培养基倍比稀释成样品浓度分别为50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.57, 0.79 mg/ml，每管300 μl。分别在试管中加入30 μl菌液（OD600约为1），置于37℃恒温培养16 h。分别取100 μl菌悬液均匀涂板。然后放37℃温箱静止培养24 h后取出， 每梯度涂布3个平板。此过程重复两次，测定最小抑菌浓度（MIC）〔5〕，筛选出抑菌活性最强的组分。

　　抑菌圈的测定：取各溶剂的浸提物30 mg，分别用相应的溶剂（无菌水、乙醇、醋酸乙酯）1 ml，制成30 mg/ml的样品溶液，用细菌过滤器过滤。在相应的固体培养基平板上加0.1 ml菌液，均匀涂布。稍干后用8 mm打孔器打孔，每孔加0.1 ml样品，37℃培养24 h，测量抑菌圈大小。