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〔摘 要〕 目的：在外源抗原表位表达载体系统中构建并表达乙型肝炎病毒(HBV)抗原表位，并对其诊断敏感性进行评价。方法：人工合成编码HBV“a”抗原决定簇表位中24个氨基酸(S124147)的寡核苷酸序列，克隆入外源抗原表位表达载体系统FHVRNA2I3位点，构建重组质粒，在原核pET系统(BL21细胞)中表达。通过ELISA和Western blot检测表达产物的抗原性，并以表达产物为包被抗原,通过ELISA和Western blot检测58份乙肝患者血清抗HBs。结果：嵌和蛋白可与抗HBs特异性结合，其ELISA检测抗HBs阳性率为77.5%，Western blot的为68%，而对照试剂盒的为62%。结论：在外源抗原表位表达系统中表达的HBV重组抗原表位具有良好的抗原性，有诊断应用价值。

　　〔关键词〕 HBV;抗原表位;抗原性;FHVRNA2载体系统

　　Study on Antigenicity of HBV Rebinant Epitope

　　Abstract：Objective Construction and Expression HBV rebinant epitope in a foreign epitope presenting vector，and eva lution of dignostic sensitivity for antiHBs with HBV epitope. Methods Oligonucleotids encoded twentyfour amino acids(aaS124147) which is within "a" antigenic deterninant were synthesized and inserted into a foreign epitopepresenting carrier I3 site (FHVRNA2cDNAI3). HBV epitope was expressed in a prokaryotic cellular system(BL21 cell). The expression product was analyzed and its antigenicity was further studied by ELISA and Wstern blot method with chimeric protein as coating antigen.we used chimeric protein as coating antigen to test antiHBs with ELISA and Wstern blot in 58 seral samples. Results The chimeric protein reacted with antiHBs seral specially.The detection positive ratio of antiHBs is 77.5% and 68%respectively by ELISA and Wstern blot with chimeric protein as coating antigen,the control's was 62%.Conclusion HBV epitope expressed in a foreign epitopepresenting carrier possessed good antigenicity and diagnostic value.

　　Key words：HBV；Epitope；Antigenicity；FHVRNA2 carrier system

　　乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原体，并引起慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生密切相关。迄今，对HBV感染最有力的预防和控制措施，仍是发展疫苗。FHVRNA2载体系统〔1〕是一个以昆虫小RNA病毒flock house virus外壳蛋白为载体的新型抗原表位表达载体，此系统中表达的载体蛋白可自动组装成病毒样颗粒，使插入的外源抗原表位可以暴露在颗粒的表面，保持天然构象和免疫学特性。本研究拟将HBV a抗原表位插入到FHV外壳蛋白上，并对其抗原性及诊断意义进行了研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞 重组质粒DNA大肠杆菌DH5α用于重组质粒pETE DNA的克隆和扩增。大肠杆菌BL21(DE3)用于重组质粒pETE DNA的表达。质粒DNA在含200 μg/ml氨苄青霉素的LB或TB培育中生长，FHVRNA2载体系统即重组pETFHV构建见〔1〕。

　　1.2 HBV抗原表位及重组pETE的构建和表达

　　1.2.1 HBV抗原表位及重组pETE的构建 人工合成HBV特异抗原表位E(氨基酸序列：124CTTPAQGNSMFPSCTKPTDGNC 147)寡核苷酸序列：正向5’GA TGC ACG ACT T GCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT C TCA TGT TGC TGT ACA AAA T ACG GAT GGA AAT TGC 3’；反向3’CT ACG TGC TGA GGA CGA GTT G TTG AGA TAC AAA GGG AGT ACA ACG ACA TGT TTT GGA TGC CTA T TTA ACG 5’，两端为Bsu36I识别位点，与经Bsu36I作用后的重组pETFHV DNA混匀后置室温连接2 h,转化DH5α细胞，接种LB平板(200 μg/ml Amp)培养。重组质粒pETE DNA经酶切筛选并经DNA序列测定。

　　1.2.2 携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达 重组pET系统中，嵌和蛋白的表达受T7启动子的控制〔2〕。BL21经重组pETE DNA转化后，在TB培养液中37 ℃生长16 h～18 h,细胞经4 000 r/10 min离心沉淀,用超声裂解缓冲液悬浮，超声裂解，裂解液经离心，弃上清，沉淀(包涵体)用8 mol/L尿素溶解。

　　1.2.3 SDSPAGE及Western blot分析 方法见前文〔1，3〕，3，3二氨基苯胺四氢盐酸(DAB)底物试剂为AMRESCO公司产品;第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司。

　　1.3 HBV重组抗原表位诊断意义评价

　　1.3.1 ELISA检测血清样本 固相ELISA检测如前文所述〔1〕，以纯化的嵌和蛋白为包被抗原，每孔100 μl(含1 μg纯化嵌和蛋白)，检测58份乙肝患者血清中抗HBs，与抗HBs ELISA检测试剂检测结果比较。阳性判断标准为(检测血清A492底物对照A值)/(阴性血清A492底物对照A值)>2.1。邻苯二胺二氢盐酸(OPD)购自AMRESCO公司；第二抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合物购自华美公司；乙肝患者血清由昆明市传染病医院收集;抗HBs ELISA检测试剂盒购自上海科华公司。

　　1.3.2 HBV重组抗原表位Western blot检测血清样本 方法见前文〔3〕，检测了58份乙肝患者血清样本。

　　2 结果

　　2.1 携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达 FHVRNA2cDNA载体系统即重组pETFHV构建见文献〔4〕，其编码产物是FHV外壳蛋白，三维立体结构已得到精确测定，其上有6个可供外源抗原表位插入的位点〔5〕(见图1)。应用该系统，我们将人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重组pETFHV DNA上，构建携带HBV抗原表位的重组质粒pETE，经NsiⅠ和NcoⅠ双酶切筛选(见图2)和DNA序列测定无误后转化BL21细胞，高水平表达嵌和蛋白。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色(见图3)和Western blot(见图4)分析结果表明，这些嵌和蛋白为携带有HBV抗原表位的重组FHV外壳蛋白。